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补体在横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤中的作用及补体抑制剂保护性研究

【摘要】:背景高强度军事训练及地震、泥石流等自然灾害都可导致横纹肌溶解症,急性肾损伤为其主要并发症。由于对横纹肌溶解致急性肾损伤的发病机制缺乏充分认识,临床无针对性治疗,病死率较高,因此,探讨横纹肌溶解致急性肾损伤的发病机制,为临床治疗寻找新的靶点,具有重大的军事意义。已有研究发现,横纹肌溶解可诱发肾脏组织氧化应激,发生炎症反应,最终走向细胞凋亡或者坏死,导致急性肾损伤。补体系统是机体重要的免疫防疫体系,对维持内环境的稳态发挥重要作用,它可以被氧化应激产物激活,对炎症反应有促进,而且对细胞凋亡有重要调控作用,很可能参与了该损伤进程。但是目前国内外对补体是否参与了横纹肌溶解导致的急性肾损伤,及其作用机制,都没有相关报道,对此进行研究并寻找潜在治疗靶点,具有十分重要的意义。目的本研究拟建立横纹肌溶解致急性肾损伤动物模型,部分大鼠提前使用补体耗竭剂(CVF)耗竭补体,通过观察肾脏损伤情况及检测关键补体蛋白、细胞因子、细胞凋亡相关蛋白,判断补体是否参与了横纹肌溶解致急性肾损伤进程,研究其激活的途径及可能作用机制;同时研究补体拮抗剂对大鼠横纹肌溶解致急性肾损伤的可能保护作用及机制。本研究分为四部分:1.横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤及补体活化;2.横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤时补体与氧化应激、炎症反应的作用;3.横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤时补体与细胞凋亡作用;4.补体拮抗剂C1INH对横纹肌溶解致急性肾损伤保护作用研究。方法1.横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤及补体活化(1)雄性SD大鼠72只,随机分为3组(n=24):对照组,尾静脉及肌注等量生理盐水;模型组,双侧后肢肌肉注射50%甘油生理盐水溶液;CVF+AKI组,甘油肌注前12小时尾静脉注射CVF,50μg/kg。并根据采血时间2 h、6 h、24 h及72小时分为4个亚组,在各时间点抽取静脉血及留取肾脏标本。(2)观察指标:①血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、C-反应蛋白(CRP)及反应补体总体水平的CH50;②肾脏病理变化;③应用免疫荧光技术、RT-PCR技术、Western-blot技术检测补体蛋白C3、Clq、B因子、MBL-A、DAF在肾脏组织的表达。2.横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤时补体与氧化应激、炎症反应的作用(1)实验分组同第一部分。(2)观察指标:①血清MDA、SOD活性;②肾脏组织MPO活性;③补体蛋白C5a、C5b-9、CD59及TNF-α、IL-6在肾脏组织的表达。3.横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤时补体与细胞凋亡作用(1)实验分组同第一部分。(2)观察指标:①Tunel法检测大鼠肾脏组织细胞凋亡;②凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Fas、caspase-12在肾脏组织的表达。4.补体拮抗剂C1INH对横纹肌溶解致急性肾损伤保护作用研究(1)雄性SD大鼠54只,随机分为3组(n=24):对照组,处理同第一部分;模型组,处理同第一部分;C1INH+AKI组,甘油肌注前2小时尾静脉注射C1INH,50U/kg。并根据采血时间6 h、24 h及72小时分为3个亚组,在各时间点抽取静脉血及留取肾脏标本。(2)观察指标:①血清尿素氮、肌酐、CH50;②肾脏组织MPO活性;③Tunel法检测大鼠肾脏组织细胞凋亡;④补体蛋白C1q、B因子、MBL-A及5a在肾脏组织的表达。结果1.横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤及补体活化(1)AKI组各时点肾功能BUN、Cr及CRP较对照组明显升高(P0.01),CH50水平明显下降(P0.01);CVF+AKI组各时点肾功能BUN、Cr及CRP较AKI组明显下降(P0.01),CH50始终维持在极低水平。(2)病理观察AKI组肾脏损伤进行性加重,损伤部位位于皮髓质交界处肾小管,24小时肾小管上皮细胞脱落、坏死,管腔见破碎细胞及管型,肾小管损伤积分明显高于对照组(P0.01);CVF+AKI组各时点损伤均轻于AKI组,肾小管损伤积分明显低于AKI组(P0.01)。(3)AKI组补体C3、C1q、B因子、MBL-A、DAF在肾脏组织的表达在各时间点都强于对照组(P0.01,P0.05),且均在肾小管表达。其中C3、MBL-A无论蛋白还是mRAN水平表达在6小时都最强;B因子、DAF表达进行性增强;C1q在2小时表达明显升高,此后下降,但是在72小时表达再次升高。CVF+AKI组各时点补体蛋白水平表达均弱于AKI组。2.横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤时补体与氧化应激、炎症反应的作用(1)AKI组血清MDA活性除了第一个时间点都明显高于对照组(P0.01),在24小时达峰值,SOD活性较对照组明显下降(P0.01),也于24小时将至最低;CVF+AKI组MDA活性除了第一个时间点外较AKI组均明显下降(P0.01),SOD活性则明显升高(P0.01)。(2)AKI组肾脏组织MPO活性较对照组明显升高(P0.01),在24小时最高;CVF+AKI组MPO活性较AKI组下降,其中6h、24h下降明显(P0.01)。(3)AKI组各时间点肾脏组织C5a、C5b-9、CD59及TNF-α、IL-6表达均明显强于对照组,其中C5a、C5b-9、IL-6在24小时表达最强,CD59、TNF-α则进行性增强;CVF+AKI组各指标表达较AKI组均减弱。3.横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤时补体与细胞凋亡作用(1)AKI组肾脏细胞凋亡率在各时间点都明显高于对照组(P0.01),在24小时达峰值;CVF+AKI组肾脏组织细胞凋亡率除了第一个时间点外较AKI组明显下降(P0.01)o(2)AKI组肾脏Bax、Fas、caspase-12表达较对照组明显增强,在24小时最高,CVF+AKI组表达AKI组明显下降;Bcl-2在AKI组表达减弱,CVF+AKI组表达也减弱,但强于AKI组。4.补体拮抗剂C1INH对横纹肌溶解致急性肾损伤保护作用研究(1)C1INH+AKI组肾功能较AKI组明显改善(P0.01),CH50下降幅度也低于 AKI 组(P0.01)。(2)C1INH+AKI组肾脏组织MPO活性较AKI组明显下降(P0.01)。(3)C1INH+AKI组肾脏组织细胞凋亡率较AKI组明显下降(P0.01)。(4)C1INH+AKI组肾脏组织C1q、B因子、MBL-A、C5a表达较AKI组明显减弱。结论1.横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤及补体的活化(1)横纹肌溶解可导致急性肾损伤,包括形态及功能;(2)补体在横纹肌溶解致急性肾损伤中发挥重要作用,耗竭补体大鼠肾脏损伤明显减轻;(3)横纹肌溶解致急性肾损伤时,补体系统可以通过三条途径激活,经典途径活补体可能在早期发挥脏器保护作用,旁路途径起着放大作用,加重了后期损伤。(4)补体调节蛋白DAF表达增强部分拮抗了补体的活化起到一定保护作用。2.横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤时补体与氧化应激、炎症反应的作用(1)横纹肌溶解致急性肾损伤发病过程有活性氧的产生,其可以激活补体,而补体活化过程产生的很多补体蛋白同时又强化氧化应激反应;(2)补体除了通过MAC发挥“溶细胞”作用外,还可以通过补体蛋白的趋化作用导致炎细胞聚集,并释放多种细胞因子、趋化因子、炎性介质,产生炎症反应,在该过程中补体又可不断被炎性因子激活,最终加重了横纹肌溶解导致的急性肾损伤;(3)在该损伤过程中,补体调节蛋白初期保护性表达上调,此后由于补体激活过度,被很多因素刺激被动升高。3.横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤时补体与细胞凋亡作用(1)活化后的补体可以影响横纹肌溶解致急性肾损伤的细胞凋亡,发挥双向调节作用,抑制炎症细胞凋亡,促进肾脏组织细胞凋亡,引起并加重肾损伤;(2)线粒体通路、死亡受体通路、内质网通路不同程度参与了横纹肌溶解致急性肾损伤时细胞凋亡信号转导。4.补体拮抗剂C1INH对横纹肌溶解致急性肾损伤保护作用研究(1)C1 INH可以减轻补体激活引起的横纹肌溶解时大鼠肾脏的损伤;(2)C1 INH可抑制补体通过三条主要通路激活,并减少C5a生成,减少炎症反应及组织的细胞凋亡,从而起到脏器保护作用。创新点:1.首次证实补体在横纹肌溶解致急性肾损伤中发挥重要作用;2.证实补体与氧化应激、炎症反应相互作用加重了横纹肌溶解导致的急性肾损伤;3.补体的激活加重了横纹肌溶解致急性肾损伤时肾脏组织细胞凋亡;4.补体拮抗剂可通过抑制炎症反应,减少细胞凋亡保护横纹肌溶解导致的急性肾损伤。研究的局限性:1.本研究是针对补体在横纹肌溶解致急性肾损伤中的作用研究,属于一般性研究,涉及面较广,但是未进行深入研究;2.整个研究未采用单个补体蛋白基因缺陷动物或者转染技术进行研究,说服力相对不足。我们出于以下考虑:首先补体蛋白众多,仅仅对关键补体蛋白进行研究,经费及精力都是极大要求,另外补体成分间多相互作用,每个补体蛋白的作用很难绝对区分。3.第四部分研究有画蛇添足的感觉,这部分篇幅虽少,也很重要。研究最终服务于临床,CVF—直作为工具药使用,没有获得临床使用批准,C1INH已经临床应用多年;CVF为了科研的目的,几乎耗竭体内补体,C1INH是部分抑制,且作用机制也不同,研究结果未必相同,而后者的研究结果对临床更有参考价值。

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