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CDK7抑制剂在胰腺癌中的机制研究

【摘要】:背景胰腺癌是一种恶性度高,侵袭性强,预后极差的肿瘤。患者在确诊时往往已属疾病晚期,依赖内科治疗。以5-Fu,吉西他滨,紫杉醇,S-1等为主的标准化疗方案给予胰腺癌患者的时间也仅8-10个月。目前厄洛替尼作为获得美国FDA(Food and Drug Administration)批准的靶向药延长生存期非常有限,急需找到有效的治疗药物。研究表明,很多肿瘤的转录过程异常激活,而抑制转录的药物CDK7抑制剂-THZ1,是Gray实验室2014年研发,第一个可以以共价键与CDK7结合,高效特异的抑制肿瘤细胞转录的小分子抑制剂。目前在三阴性乳腺癌,小细胞肺癌,卵巢癌,AML,ALL等难治性肿瘤中得到证实,可显著抑制肿瘤细胞增殖。而在胰腺癌中,尚无此类报道,因此,拟准备在胰腺癌中研究CDK7抑制剂THZ1的疗效。方法实验分为三部分,第一部分为在胰腺癌细胞系中检测CDK7抑制剂的疗效,第二部分探讨可能的CDK7下游作用靶点,第三部分为分析胰腺癌患者标本CDK7表达与预后的关系。在第一部分试验,我们在不同胰腺癌细胞系中加入CDK7抑制剂-THZ1,MTS测试十种胰腺癌细胞系增殖状态,Caspase3/7测试细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期变化,以及Westen blot检测凋亡,周期,以及细胞转录相关蛋白的变化。更进一步的,使用CRISPR/Cas9技术敲除CDK7基因,克隆形成实验检测胰腺癌细胞系增殖变化,以及Western检测凋亡相关蛋白变化。在第二部分试验,我们在CAPAN2细胞系中,采用ChIP的实验方法,使用H3K27ac抗体,研究受THZ1作用,可能调控的下游通路。然后在胰腺癌细胞中,THZ1药物处理,检测RNA和蛋白水平相应靶基因以及蛋白水平的变化。在第三部分试验,使用免疫组化方法,检测胰腺癌患者手术标本CDK7表达水平,两名病理医生独立评分。运用Kaplan-Meier绘制生存曲线,log-rank检验组间差异,以及多因素分析Cox模型检测其与预后的关系。结合公共数据库TCGA转录组结果,Kaplan-Meier绘制生存曲线,log-rank分析CDK7转录组水平与预后的关系。结果我们可以观察到,在10种胰腺癌细胞系CAPAN2,PANC03.27,PSN-1,SW1990,Hs766T,PANC02.03,PANC10.05,PANC08.13,HUPT3,BXPC3 中,胰腺癌细胞对 THZ1药物非常敏感,加入THZ1之后,十种胰腺癌细胞系中增殖显著降低,且平均药物IC50甚至低于 200nM。CAPAN2,PANC03.27,SW1990,PSN-1,Hs766T 胰腺癌细胞加入 THZ1处理后,促进肿瘤细胞凋亡,在CAPAN2以及PANC03.27细胞系中非常显著。然而,不同于小细胞肺癌,卵巢癌,在胰腺癌细胞系中,THZ1对细胞周期并无显著影响,这点与三阴性乳腺癌相同。同时,我们发现,RNApolymerase II CTD(carboxy-terminal domain)的Ser5,7,2位点随着THZ1药物浓度增加或者药物作用时间延长,其磷酸化水平降低,从而抑制转录。在CAPAN2,PANC03.27细胞系中,我们使用CRISPR/Cas9技术敲除CDK7之后,CDK7蛋白水平基本没有表达,克隆形成实验显示,肿瘤细胞增殖显著受到抑制。凋亡相关蛋白Cleaved-PARP水平显著增高,抗凋亡蛋白MCL1显著下降。因此机制上可以证实胰腺癌细胞生长对CDK7蛋白的依赖。此后,在CAPAN2细胞系中,我们进行了 ChIP实验。使用H3K27ac作为目标抗体,研究发现,THZ1可减弱H3K27ac与PIK3CA基因的结合。THZ1药物处理细胞之后,PI3KCAmRNA表达水平也降低,同时发现PI3K蛋白表达降低,磷酸化AKT降低,以及磷酸化的mTOR水平降低,推测,THZ1可能抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路。我们将胰腺癌术后患者CDK7蛋白表达水平按照强度跟范围分为高低两组,多因素分析显示,CDK7蛋白高表达组总生存较CDK7蛋白低表达组生存期缩短(multivariateHR:1.25,95%CI:1.00-1.57),15 个月对比 18.2 个月(P=0.045)。TCGA公共数据库分析显示,CDK7转录组水平高表达患者预后显著差于CDK7低表达患者,中位 OS 分别为 16.2 个月(95%CI:13.6-18.8)和 22.0 个月(95%CI:19.0-25.0),差异有统计学意义(P=0.036)。结论THZ1在胰腺癌细胞系中可高效结合CDK7蛋白,显著抑制胰腺癌细胞增殖,引发胰腺癌细胞凋亡,抑制转录过程。在机制探索中,THZ1可能抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,从而抑制增殖过程。在胰腺癌患者中,CDK7分子水平高表达,与较差的预后相关。CDK7抑制剂在胰腺癌中是一种颇具治疗前景的药物,期待进一步的临床试验,为胰腺癌患者的治疗带来曙光。

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