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突变型HBx在HCC发生发展中的致癌作用及机制研究

【摘要】:【研究背景】全球范围内有超过2.4亿人发生慢性乙肝的感染,每年约有60万人因为HBV感染所致肝病死亡。在亚洲及撒哈拉以南的非洲地区,因为HBV感染的流行,HCC发生明显高于其他地区。HCC发生最为相关的危险因素就是HBV感染,HBx蛋白作为HBV编码的最小蛋白,具有反式激活因子功能,可以通过蛋白与蛋白之间的相互作用,刺激病毒复制或改变宿主基因的表达,从而促进HCC发生发展。由于HBV病毒在复制过程中缺乏校正功能,所以HBV基因常常发生突变。HCC病人就经常发现HBx基因突变,并且HBx基因的突变在HCC发生发展的过程中是逐渐累积的。与HCC发生风险相关的常见HBx突变有G1613A、C1653T、T1674C/G、T1753V、T1768A以及A1762T/G1764A双突变。转染含有这些突变的HBx质粒可以促进细胞的增殖迁移能力。然而目前的研究都是从单一的分子或是信号通路着手,利用生物信息学的方法,从促炎促癌信号网络解释HBx基因突变是如何促进肝癌发生的研究目前还十分缺乏。【研究目的】本研究利用生物信息学的方法,以炎症信号网络为着手点,研究HBx基因突变是如何通过改变炎症或是促癌信号网络来促进HCC发生发展的。为寻找HBV-HCC诊断和治疗新靶点奠定基础。【研究方法】首先通过PCR的方法,以HCC病人血清中提取的HBV DNA为模板扩增HBx基因片段,并构建相应的慢病毒及睡美人转座子质粒。其中包括野生型、突变型以及C端截短型的HBx。利用慢病毒载体及睡美人转座子质粒,在肝癌HepG2细胞及睡美人小鼠中成功表达HBx蛋白。通过检测HepG2细胞的增殖、迁移、侵袭能力,明确突变型HBx在肝癌细胞内的致癌能力;通过检测小鼠生癌及炎症因子表达情况,明确突变型HBx在动物体内的促炎、促癌能力。其次,分析HTA2.0芯片信噪比富集GSEA基因项,对富集到的基因绘制蛋白-蛋白相互作用网络,在最致密的蛋白-蛋白相互作用模块中寻找突变型HBx与野生型HBx相比差异较大的关键节点分子。紧接着在HTA2.0及Agilent芯片中,通过突变型HBx与野生型HBx比较得到的差异基因富集GSEA基因项,并找到HTA2.0及Agilent芯片中共有的基因项,从而寻找HBx基因突变在体内外实验中共同改变的促炎促癌信号通路。最后在细胞及小鼠体内验证候选的炎症信号通路及关键调控分子,找到HBx突变调控的关键基因。【研究结果】1.通过PCR的方法,以病人血清中提取的HBV DNA为模板,扩增突变型、C端截短型及野生型HBx片段并构建到慢病毒及睡美人转座子中,各种突变型hbx片段涉及到的hcc及肝硬化相关突变如下:m1突变型:a1727g+a1762t/g1764a;m2突变型:t1753a+a1762t/g1764a;m3突变型:a1762t/g1764a;m4突变型:c1653t+t1674g+a1762t/g1764ac端截短型:nt.1733位点g→a突变,原密码子由tgg变为终止密码子tga从而发生截短。首先,通过慢病毒系统成功在hepg2细胞中表达各种突变型、c端截短型以及野生型hbx蛋白。其次,通过细胞周期、增殖、迁移及侵袭实验发现,与野生型hbx相比,突变型hbx可以加速细胞周期进程,促进细胞增殖。表达m3、m4、ct型hbx的hepg2细胞处于s期的比例要高于表达野生型hbx的细胞(p值分别为0.016,0.006以及0.024)。表达m4突变型hbx的hepg2细胞增殖能力明显比表达野生型hbx以及空载体组的细胞要高(p值分别为0.001和0.001)。裸鼠成瘤实验也发现,m4突变型组裸鼠皮下肿瘤重量要明显高于野生型组(p=0.039)。2.利用睡美人转座子系统在睡美人小鼠肝脏中成功表达突变型、c端截短型以及野生型hbx蛋白。统计小鼠肝脏生瘤情况发现,突变型、c端截短型组小鼠的生瘤率及生瘤大小要普遍高于野生型组。m4突变及c端截短型组生瘤率显著高于野生型、空载体组(m4vs.wt,p=0.010;m4vs.vector,p0.001;ctvs.vector,p=0.019)。突变型组小鼠的肿瘤与肝脏重量比值要高于野生型及空载体组,其中m4突变型组显著高于野生型及空载体组(p值分别为0.012和0.005)。同时,检测小鼠血清炎症因子的表达水平,发现m4突变型组il-6表达水平要显著高于空载体组(p=0.024);m4突变型组il-5表达水平要显著高于野生型及空载体组(p值分别为0.010和0.043);m4突变型组ifn-γ的表达水平要显著高于野生型及空载体组(p值分别为0.029和0.005);突变型组中,il-1β、il-12p70、ifn-α以及il-4的检出率均高于野生型或空载体组。3.hta2.0芯片通过信噪比富集gsea基因项并绘制蛋白-蛋白相互作用网络。通过突变型hbx与野生型hbx组相比,在最致密的蛋白-蛋白相互作用模块中寻找差异关键节点分子:cdc20、pai-1等。利用hta2.0及agilent芯片差异基因富集gsea基因集,并找到共同富集到的gsea基因项,其中包括il-6炎症信号通路及部分癌症相关信号通路。4.通过rt-qpcr实验发现hepg2细胞中,突变型及c端截短型组cdc20mRNA水平显著高于野生型组(M3 vs.Wt,p=0.026;M4 vs.Wt,p0.001;Ct vs.Wt,p0.001);PAI-1 mRNA水平也具有相同的结果(M4 vs.Wt,p=0.001;Ct vs.Wt,p0.001)。蛋白水平检测明确了突变型HBx较野生型HBx上调CDC20、PAI-1基因的表达的能力更强;这在小鼠肝脏免疫组化结果中同样被证实。小鼠炎症因子检测则明确了M4突变型组IL-6表达水平显著高于野生型组或空载体组(p值分别为0.083和0.024)。以上结果证明了与野生型HBx相比,突变型HBx更能促进IL-6通路的激活以及CDC20和PAI-1基因的表达。5.M4突变型HBx较野生型HBx能够显著提高HepG2细胞的增殖能力,当敲低CDC20或PAI-1基因表达后,瞬时转染含有M4突变型HBx或野生型HBx的质粒,两组HepG2细胞增殖能力相当。因此,推断突变型HBx是通过上调CDC20、PAI-1基因表达促进细胞增殖的。【研究结论】突变型较野生型HBx具有更强的促炎、促细胞增殖等致癌能力。并且,与野生型HBx相比,突变型HBx可以通过促进CDC20、PAI-1基因的表达来促进细胞增殖,从而促进HCC发生发展进程.

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