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PD-1对脓毒症小鼠肝脏枯否细胞功能的影响与机制研究

【摘要】:【研究目的】 脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征,死亡率一直居高不下。免疫抑制是脓毒症后期常见的免疫异常状态。巨噬细胞功能障碍是这种免疫抑制的一个重要原因,但是其具体发生机制目前尚不明了。 程序性死亡分子1(programmed cell death1, PD-1)是近年来发现的共抑制受体,参与外周组织免疫耐受和慢性病毒感染。PD-1基因敲除可以显著提高脓毒症小鼠的生存率,提示PD-1在脓毒症免疫抑制中发挥着重要的作用。本课题拟首先检测PD-1在肝脏枯否细胞的表达,进而应用PD-1基因敲除小鼠,观察PD-1在脓毒症肝脏枯否细胞功能障碍的作用,并初步探索PD-1在枯否细胞发挥作用的分子机制及PD-1参与脓毒症多器官功能障碍的分子机制。 【研究方法】 1、复制盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)致脓毒症小鼠模型。将16只野生型C57BL/6小鼠随机分为假手术组(Sham, n=8)和CLP组(CLP, n=8)。术后24h时取肝脏,分离肝脏非实质细胞,应用流式细胞仪检测枯否细胞(F4/80+)表面PD-1的表达水平。 2、将10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组(WT Sham, n=4),PD-1基因敲除假手术组(PD-1-/-Sham, n=4),野生型CLP组(WT CLP, n=6)和PD-1基因敲除CLP组(PD-1-/-CLP, n=6)。术后24h时,分离肝脏非实质细胞,应用流式细胞仪检测枯否细胞表面MHCΠ、CD69、CD80和CD86的表达水平。 3、将8只野生型C57BL/6小鼠及8只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组(WT Sham, n=4),PD-1基因敲除假手术组(PD-1-/-Sham, n=4),野生型CLP组(WT CLP, n=4)和PD-1基因敲除CLP组(PD-1-/-CLP, n=4)。术后24h时,分离肝脏非实质细胞,贴壁法纯化枯否细胞。加入分子探针pHrodoTME. coli BioParticlesConjugate共培养1h,应用流式细胞仪检测枯否细胞吞噬功能。 4、将10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组(WT Sham, n=4),PD-1基因敲除假手术组(PD-1-/-Sham, n=4),野生型CLP组(WT CLP, n=6)和PD-1基因敲除CLP组(PD-1-/-CLP, n=6)。术后24h时,分离肝脏非实质细胞,贴壁法纯化枯否细胞。LPS(1μg/ml)刺激或不刺激24h后收集培养上清及细胞,ELISA法检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40和MCP-1水平。 5、将10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组(WT Sham, n=4),PD-1基因敲除假手术组(PD-1-/-Sham, n=4),野生型CLP组(WT CLP, n=6)和PD-1基因敲除CLP组(PD-1-/-CLP, n=6)。术后24h时,分离肝脏非实质细胞,贴壁法纯化枯否细胞。LPS(1μg/ml)刺激24h后收集细胞,Westernblot法检测cleaved caspase-3的水平。 6、将10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组(WT Sham, n=4),PD-1基因敲除假手术组(PD-1-/-Sham, n=4),野生型CLP组(WT CLP, n=6)和PD-1基因敲除CLP组(PD-1-/-CLP, n=6)。术后24h时,分离肝脏非实质细胞,贴壁法纯化枯否细胞。LPS(1μg/ml)刺激24h后收集细胞,TUNEL法检测凋亡情况。 7、将10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组(WT Sham, n=4),PD-1基因敲除假手术组(PD-1-/-Sham, n=4),野生型CLP组(WT CLP, n=6)和PD-1基因敲除CLP组(PD-1-/-CLP, n=6)。术后24h时,分离肝脏非实质细胞,贴壁法纯化枯否细胞。LPS(1μg/ml)刺激10min后收集细胞,Western blot法检测磷酸化Akt及总Akt水平。 8、将10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组(WT Sham, n=4),PD-1基因敲除假手术组(PD-1-/-Sham, n=4),野生型CLP组(WT CLP, n=6)和PD-1基因敲除CLP组(PD-1-/-CLP, n=6)。术后24h时,分离肝脏非实质细胞,贴壁法纯化枯否细胞。LPS(1μg/ml)刺激10min后收集细胞,Western blot法检测磷酸化p38及总p38水平。 9、将10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组(WT Sham, n=4),PD-1基因敲除假手术组(PD-1-/-Sham, n=4),野生型CLP组(WT CLP, n=6)和PD-1基因敲除CLP组(PD-1-/-CLP, n=6)。术后24h时,取心脏、肝脏和肾脏。组织匀浆,Western blot法检测磷酸化Akt、总Akt、磷酸化STAT3和总STAT3水平。 【结果】 1、术后24h时,脓毒症小鼠肝脏枯否细胞表面PD-1表达显著高于假手术组(P0.001). 2、术后24h时,野生型脓毒症小鼠肝脏枯否细胞表面MHCΠ、CD86表达均显著低于野生型假手术组(P 0.001),CD80表达显著高于野生型假手术组(P 0.001)。PD-1基因敲除可部分但显著恢复枯否细胞表面MHCΠ、CD80和CD86表达(P 0.001)。各组CD69表达无显著改变。 3、术后24h时,野生型脓毒症小鼠肝脏枯否细胞吞噬功能显著下降(P 0.01),PD-1基因敲除脓毒症小鼠可显著增强枯否细胞功能(P 0.001)。 4、术后24h分离肝脏枯否细胞,体外LPS继续刺激或不刺激24h时,野生型脓毒症小鼠肝脏枯否细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40和MCP-1能力显著下降(P 0.05)。PD-1基因敲除可部分但显著恢复枯否细胞分泌上述细胞因子能力。 5、术后24h分离肝脏枯否细胞,体外LPS继续刺激24h时,野生型脓毒症小鼠肝脏枯否细胞cleaved caspase-3水平显著升高(P 0.001),PD-1基因敲除可显著减少枯否细胞cleaved caspase-3水平(P 0.001)。 6、术后24h分离肝脏枯否细胞,体外LPS继续刺激24h时,野生型脓毒症小鼠肝脏枯否细胞TUNEL染色阳性比例显著升高,PD-1基因敲除可显著减少枯否细胞TUNEL染色阳性比例。 7、术后24h分离肝脏枯否细胞,体外LPS继续刺激10min时,野生型脓毒症小鼠肝脏枯否细胞磷酸化Akt/总Akt比例显著降低(P 0.001),PD-1基因敲除可显著增加枯否细胞磷酸化Akt/总Akt比例(P 0.001)。 8、术后24h分离肝脏枯否细胞,体外LPS继续刺激10min时,野生型脓毒症小鼠肝脏枯否细胞磷酸化p38/总p38比例显著升高(P 0.001),PD-1基因敲除可显著减少枯否细胞磷酸化p38/总p38比例(P 0.001)。 9、术后24h时,野生型脓毒症小鼠心脏、肝脏和肾脏磷酸化Akt/总Akt比例显著降低,PD-1基因敲除可显著增加肝脏和肾脏磷酸化Akt/总Akt比例,但心脏磷酸化Akt/总Akt比例无显著变化。野生型脓毒症小鼠心脏、肝脏和肾脏磷酸化STAT3/总STAT3比例显著升高,PD-1基因敲除可显著减少心脏和肾脏磷酸化STAT3/总STAT3比例,但是肝脏STAT3/总STAT3比例无显著变化。 【结论】 PD-1参与了脓毒症导致的肝脏枯否细胞功能障碍,可能通过影响枯否细胞Akt磷酸化和p38磷酸化发挥作用,还可能通过影响Akt磷酸化和STAT3磷酸化参与脓毒症导致的多器官功能障碍。

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