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食管癌比较蛋白质组学初步研究

【摘要】:食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一,近年来大量统计资料表明,我国的食管癌发病率和死亡率呈逐年升高。早期预测和诊断食管癌是提高食管癌生存率的关键,对改善食管癌预后有重要意义。蛋白质组学研究方法和技术为食管癌发生分子机制及早期诊断和预防的研究提供了有利条件。 本研究以正常食管粘膜和食管癌组织为研究对象,采用比较蛋白质组技术鉴定了6个与食管癌发生相关的候选蛋白,并探讨了HSP27和ANX1在食管癌发生中的作用及其功能,具体研究结果如下: 1、食管癌组织蛋白质双向凝胶电泳技术的建立及其优化 优化食管组织的蛋白质样品制备方法,建立食管组织的双向凝胶电泳(2-DE)图谱,为识别鉴定食管癌发生相关蛋白质奠定基础。在此基础上我们初步建立了分辨率较高且重复性好的食管组织蛋白质双向凝胶电泳图谱。 2、正常食管粘膜和食管癌组织的蛋白质组双向凝胶电泳分析 为了更好的理解食管癌发生机理和寻找食管癌的标志分子,我们运用双向凝胶电泳技术对正常食管粘膜和食管癌组织进行了差异表达双向凝胶电泳分析,数字化图像分析发现有48个蛋白质斑点在两组凝胶中有显著差异表达,在食管癌中表达量升高的蛋白质斑点有20个,在正常食管中表达量升高的蛋白质斑点有28个;定性差异表达分析(表达量相差10倍以上)发现14个蛋白质斑点仅在食管癌中出现,而有18个蛋白质斑点只在正常食管粘膜中检测到,结合软件分析和手工筛选,选取6个点清晰且表达水平改变明显的蛋白质点作为质谱鉴定的靶点。 3、双向凝胶电泳差异表达蛋白质的质谱鉴定和验证 以正常食管粘膜和食管癌组织为研究对象,采用2-DE分离技术结合MALDI-TOF质谱鉴定了6个与食管癌发生相关的蛋白,其中食管癌组织中表达上调的蛋白质有磷酸丙糖异构酶1、锰超氧化物歧化酶和热休克蛋白27,而鳞状细胞癌抗原1、细胞角蛋白4和膜联蛋白I在食管癌中表达下调。大多数差异蛋白功能涉及肿瘤细胞生长、运动、凋亡等过程,研究结果为阐明食管癌发生机制及寻找食管癌的潜在标志物提供了理论依据。 为保证蛋白质组技术鉴定结果的可靠性,在mRNA水平对候选蛋白进行了进一步验证。采用半定量RT-PCR技术对编码候选蛋白的mRNA水平检测结果表明:SCCA1、KRT4和ANXl在食管癌组织中的表达比其正常组织表达低,而TIM1、MnSOD和HSP27在食管癌组织中的表达比其正常组织表达高,RT-PCR的结果与蛋白质组学技术的鉴定结果完全一致,说明候选蛋白在食管癌中的蛋白水平变化主要是由于基因的转录水平高低不同所致,也肯定了候选蛋白在正常食管粘膜和食管癌组织中的差异表达。结果表明通过蛋白质组技术筛选到的肿瘤相关蛋白是可靠的。 4、热休克蛋白27与食管癌发生的相关性分析 为更好的理解食管癌发生机理和寻找可能的肿瘤诊断标记分子标志物,我们用蛋白质组学方法对正常食管组织和食管癌组织的差异表达蛋白进行了研究,免疫组织化学进一步验证和分析了热休克蛋白27和膜联蛋白1蛋白在正常食管组织和食管癌组织中的差异表达和定位。40例临床食管癌组织标本的免疫组织化学研究发现热休克蛋白27表达和膜联蛋白1缺失与食管癌发生显著相关。结果表明,食管癌热休克蛋白27的表达和和膜联蛋白1的缺失与肿瘤发生相关,可能在恶性转型中发挥重要的作用。 综上所述,本研究应用比较蛋白质组技术对正常食管粘膜和食管癌组织进行了对比研究,获得了6个差异表达蛋白质并对HSP27和ANX1进行了初步验证。分析结果证实食管癌热休克蛋白27的表达和ANX1的缺失与肿瘤细胞的发生相关,在食管癌恶性转型中发挥重要的作用,可能是阻止食管癌发生的关键分子之一,研究结果将为食管癌发生相关研究和药物的筛选提供有用的研究信息和药物分子靶标。

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