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多壁碳纳米管介导的光热疗法联合化疗治疗骨转移肿瘤

【摘要】:肿瘤骨转移常见于多种晚期恶性肿瘤,约70%的晚期乳腺癌及前列腺癌患者,以及35%的晚期肺癌患者会发生骨转移。恶性肿瘤骨转移可导致顽固性骨痛、高钙血症、病理性骨折等并发症,严重影响患者的生活质量及预期生存期。手术及化疗作为目前主要的治疗方法,都有各自的不足。手术的适应症窄,只适应于治疗病灶局限且未发生远处转移的肿瘤。化疗的毒副作用大,且长时间应用易导致耐药性。另外,骨髓腔里丰富的血管微循环为骨肿瘤生长提供了良好的环境,并易导致肿瘤细胞获得耐药性,增加了彻底根治肿瘤的难度。热疗作为一种新型的治疗方法,具有创伤小、适应症广等优点。传统的热疗包括射频消融、聚焦超声及微波治疗等。但是传统热疗手段也存在特异性不足,易损伤正常组织等缺点。针对传统热疗的不足,急需一种特异性好,副作用少的新型治疗方法。光热疗法作为一种新型的治疗技术,可以根据肿瘤的种类调节照射光源大小及强度,对肿瘤组织进行均匀加热治疗,具有适应症广,特异型好,并发症少等优点。光热疗法的原理是利用近红外激光照射光热材料产生的热量杀伤肿瘤细胞。本研究选用多壁碳纳米管(MWNTs)作为光热材料。MWNTs是一种由多层石墨稀按照一定方向卷绕而成的无缝管状纳米材料,在近红外光谱范围有很强的吸收,并能将这些能量高效地转化为热量,而近红外光谱范围光线对生物体有非常好的穿透性,MWNTs的这一特性使其能够广泛应用于肿瘤热疗。近年来,大量文献报道MWNTs作为光热材料应用于肿瘤的治疗,取得了很好的疗效。文献报道MWNTs联合近红外激光治疗肿瘤可以获得很好的疗效,但主要进行细胞实验研究,动物实验研究较少,且动物肿瘤模型大部分采用皮下肿瘤造模,不能模拟正常的肿瘤生长环境。目前,关于MWNTs联合近红外激光治疗骨转移肿瘤尚未见文献报道。本研究第一部分拟采用小鼠胫骨肿瘤模型,评价MWNTs介导的光热治疗对骨肿瘤的治疗效果。骨转移肿瘤治疗方法多种多样,传统的治疗方法有手术,化疗,放疗等,新型的治疗方法有免疫疗法、热疗、光热疗法等。但是恶性肿瘤骨转移生长迅速,易发生远处转移,常见并发症包括溶骨性破坏、剧烈疼痛、病理性骨折、高钙血症等。任何单一的治疗手段,都很难彻底根除肿瘤病灶。另外,各种治疗方法的适应症不同,单一的治疗方法也不利于对肿瘤进行全面治疗。采用两种方法或多种方法联合治疗可以增强治疗效果,降低单一治疗的副作用,成为目前研究的热点。文献证明,热疗与化疗联合可以达到协同作用的效果,增强治疗效果同时降低治疗副作用。其机制有以下几方面:(1)热疗本身高热直接杀伤肿瘤细胞,同时热疗产生的高温可以增强部分化疗药物的细胞毒性;(2)加热可以促进肿瘤局部的温度,增加肿瘤组织的血液循环及细胞膜的通透性,增加肿瘤组织对化疗药物的摄取;(3)热疗产生的高热还可以增加部分炎症因子的表达,增强治疗效果。本研究第一部分证实,MWNTs介导的光热疗法可以有效抑制骨转移肿瘤生长及抑制骨破坏,但是单纯光热治疗无法彻底杀灭肿瘤细胞。为了增强治疗效果,本研究第二部分采用的光热疗法与化疗联合治疗骨转移肿瘤,通过荷瘤小鼠模型,评估的联合治疗的疗效及安全性。第一部分MWNTs介导的光热疗法治疗骨转移肿瘤目的:评价MWNTs介导的光热疗法治疗骨转移肿瘤的疗效及安全性。方法:通过浓硝酸纯化MWNTs,得到O-MWNTs。使用DSPE-PEG2000对MWNTs进行化学功能化。核磁共振(NMR),透射电镜(TEM)等仪器对所合成的MWNTs样品进行鉴定。使用CCK8法评价MWNTs介导的光热疗法对肿瘤细胞存活率的影响;使用死活细胞染色试剂盒,对细胞进行染色,共聚焦下观察肿瘤细胞的活性。在Balb/c裸鼠胫骨接种1.0×106 EMT6乳腺癌细胞建立荷瘤动物模型进行体内实验,验证激光照射MWNTs的体内热效应,并用数显游标卡尺记录各组骨肿瘤的生长、Micro-CT分析骨破坏情况。记录光热治疗后小鼠足底触觉疼痛阈值变化及体重变化,评价该疗法的安全性。结果:电镜结果显示未修饰的MWNTs团聚现象严重,PEG修饰后,可见MWNTs分散均匀,呈单管状分布。通过计算100条MWNTs的长度,得其长度大约为1126±389nm。O-MWNTs-PEG核磁图谱不仅有溶剂特征峰,还有明显的PEG结构特征峰,说明成功构建PEG修饰的O-MWNTs。MWNTs稳定性测试显示原始MWNTs 24h后沉积于瓶底,而PEG修饰过的MWNTs 30天后仍稳定存在,证明PEG修饰后的O-MWNTs具有良好的水溶性及稳定性。体外热效应结果提示MWNTs温度升高与激光照射时间(0-240s)和MWNTs浓度的(0-100 μg/ml)呈正相关。本部分研究得到PEG修饰的MWNTs,为后期的材料应用打下了基础。CCK8结果表明,MWNTs空白载体在剂量范围内对人乳腺癌细胞MDA-231及MCF-7细胞毒性很小,而MWNTs介导的光热疗法能明显降低肿瘤细胞的活性。死活细胞染色证明MWNTs介导的光热疗法可以明显导致肿瘤细胞死亡。体外细胞实验证实MWNTs介导的光热疗法可以有效杀伤肿瘤细胞。体内热成像结果显示MWNTs联合激光照射与单纯激光照射相比,可以明显升高局部温度。而且,随着照射时间的延长,温度升高也更加明显。10μg MWNTs联合激光照射温度高于1μg MWNTs联合激光照射,证明温度升高也与MWNTs浓度相关。MWNTs介导的光热疗法可以明显抑制骨肿瘤的生长,单纯激光照射组与10μg MWNTs组小鼠肿瘤体积与生理盐水组肿瘤体积大小无统计学意义(P0.05)。但是,10μg MWNTs联合激光照射组肿瘤体积明显小于生理盐水组肿瘤体积(P0.01)。而且肿瘤抑制效果与剂量相关,10μg MWNTs联合激光照射组肿瘤体积明显小于1μg MWNTs联合激光照射组(P0.05)。Micro-CT分析骨破坏情况发现,对照组、单纯照射组及单纯MWNTs组骨组织破坏情况严重,三维重建图可见大量骨破坏及骨增生,正常骨组织结构基本上看不到,证实单独激光照射及单独的MWNTs均不能减轻骨破坏,而1μg MWNTs(低剂量)联合激光照射组仅可见轻度的骨破坏伴随轻度的骨增生,骨组织结构大体正常,而10μg MWNTs(高剂量)联合激光照射组骨组织形态基本正常,骨结构完整。骨体积结果也证实,10μg MWNTs(高剂量)联合激光照射组骨体积明显低于对照组(p0.05),而1μg MWNTs(低剂量)联合激光照射组骨体积与对照组无统计学意义(p0.05)。因此,10μg MWNTs(高剂量)联合激光照射组可以有效减轻骨破坏。MWNTs联合激光照射组与各对照组相比,可以明显抑制载瘤鼠的骨肿瘤生长,并且减轻载瘤鼠的骨破坏。足底触觉疼痛阈值及体重测量结果显示MWNTs介导光热治疗后,小鼠足底触觉疼痛阈值及体重与生理盐水组相比,并没有明显改变,证明光热治疗具有良好的生物安全性。结论:光热疗法产生的温度与激光照射时间及MWNTs浓度呈正相关;MWNTs介导的光热疗法可以有效抑制骨肿瘤生长并减轻骨破坏,而且该疗法具有良好的生物安全性。第二部分MWNTs/Dox介导的光热疗法联合化疗治疗骨转移肿瘤目的:评价MWNTs/Dox介导的光热疗法联合化疗治疗骨转移肿瘤的疗效及安全性。方法:通过H2S04和HN03混和酸(3:1,v/v),纯化、截短MWNTs,DSPE-PEG2000对MWNTs进行化学功能化修饰,构建O-MWNTs-PEG复合物。使用显微拉曼光谱仪、傅立叶红外光谱仪、核磁共振(NMR),透射电镜(TEM)等仪器对所合成的MWNTs样品进行表征。通过π-π吸附将Dox吸附于MWNTs表面,并测试了 MWNTs/Dox的载药率、不同PH值环境下药物释放率及激光照射下药物释放率。使用CCK8法评价MWNTs/Dox介导的光热疗法联合化疗对肿瘤细胞存活率的影响。在Balb/c裸鼠胫骨接种1.0×106 MDA-231乳腺癌细胞建立荷瘤动物模型进行体内实验,验证MWNTs/Dox介导的光热疗法联合化疗的体内热效应、数显游标卡尺测量骨肿瘤生长、Micro-CT及HE染色分析骨破坏情况。观察MWNTs/Dox介导的光热疗法联合化疗后各重要器官的HE染色及小鼠体重,评价该疗法的安全性。结果:结果表明,强酸成功对MWNTs进行截短,获得长度大约为99.57 ±61.20nm的纳米管。傅里叶结果显示,强酸处理后MWNTs在1210 cm-1处出现一峰值,为C-O健的共振波,表明强酸氧化MWNTs后,竣基集团引入了纳米管管壁。拉曼光谱显示,强酸处理后MWNTs D bands明显高于G bands,表明强酸氧化MWNTs后,多壁碳纳米管管壁出现一定程度缺陷,这一特质有利于后期对MWNTs的修饰。1H NMR结果显示PEG成功搭载在MWNTs表面,O-MWNTs-PEG具有良好的粒径分布,能够在数星期甚至数月中保持稳定。MWNTs溶液温度随着照射强度的增加而增加。1W/cm2照射60s,温度为42.6±0.26℃,1.2 W/cm2 照射 60s,温度升高为 49.2±0.89℃(P0.05),而 1.5 W/cm2照射60s后,温度升高达58.1 ± 1.10℃(P0.05)。经过PEG修饰明显提高了MWNTs的水溶性及稳定性,且具有良好的光热转化效率,为后期的材料应用打下了基础。载药率测试证实载药率高达88.57%。载药后,MWNTs/Dox溶液颜色出现Dox特有的暗红色。同时,MWNTs/Dox紫外图谱中出现Dox紫外吸收峰,说明Dox通过π-π附在O-MWNTs-PEG的表面。pH 7.4 PBS中,MWNTs/Dox 中 Dox 48h 的累积释放量达到 40.69%。MWNTs/Dox 在在pH5.5 PBS中,药物释放更迅速,48h的累积释放量达到77.41%。而在pH 9.0的PBS中48 h的累积释放量仅为8.39%。Dox释放具有pH敏感性,酸性环境pH促进药物释放,中性环境pH药物释放缓慢,碱性环境pH不易释放。激光照射可加速药物释放,激光照射10min,药物释放高达28.08%,而对照组仅释放2.14%。说明激光照射材料可以加速药物的释放,有利于增强联合治疗的疗效。MWNTs/Dox介导的光热疗法联合化疗可以明显抑制肿瘤细胞生存,对人乳腺癌细胞MDA-231的抑制率明显高于单纯Dox及单纯MWNTs介导的光热疗法。单独808nm激光照射2min,细胞活性没有明显改变,但是808nm激光照射100μg/ml的MWNTs的溶液2min,细胞活性明显下降为49.5%,说明MWNTs介导的光热疗法可以有效杀死肿瘤细胞。单独10 μg/ml Dox培养,细胞活性下降为78.1%,Dox联合激光照射时,细胞活性为75.8%,细胞活性并未明显改变。单独MWNTs/Dox培养,细胞活性为75.8%,但是MWNTs/Dox联合激光照射后,细胞活性明显下降为35.7%。证明光热疗法联合化疗肿瘤抑制效果优于单纯化疗或是单纯光热治疗。激光照射联合MWNTs可以明显升高局部温度,瘤内注射2μg MWNTs及MWNTs/Dox 808 nm激光照射60s,局部温度分别高达48.4±5.76℃,48.8±6.31℃,而单纯照射组温度仅仅为 38.3±0.25℃。MWNTs 及 MWNTs/Dox经激光照射后,温度均明显升高,证明搭载药物后不影响MWNTs光热效应。MWNTs/Dox介导的光热疗法联合化疗与单纯Dox或是单纯MWNTs介导的光热疗法相比,抑制载瘤鼠的肿瘤生长更加明显。Micro-CT分析骨破坏情况发现,生理盐水组、Dox组骨组织破坏严重,三维重建图可见大量骨破坏,证实单独Dox注射不能抑制骨破坏。MWNTs联合激光照射组骨破坏较生理盐水组、Dox组轻,但仍可见大段骨组织缺损,而MWNTs/Dox联合激光照射组骨破坏最轻,骨组织形态基本正常,骨结构完整。因此,化疗联合光热疗法不仅可以有效减缓骨转移肿瘤的生长,而且可以有效减轻骨破坏。MWNTs/Dox介导的光热疗法联合化疗后,各重要器官的HE染色及小鼠体重与生理盐水组相比,并没有明显改变,证明MWNTs/Dox介导的光热疗法联合化疗是相对安全的。结论:MWNTs/Dox介导的光热疗法联合化疗对骨转移肿瘤治疗效果优于单纯光热治疗或是单纯化疗,且联合治疗具有良好的生物安全性。本研究分别研究了 MWNTs介导的光热疗法及MWNTs/Dox介导的光热疗法联合化疗治疗骨转移肿瘤的疗效及安全性。第一部分证实,MWNTs介导的光热疗法可以有效减缓骨转移肿瘤的生长及减轻骨破坏,而且该疗法具有良好的生物安全性。但是,单纯光热疗法无法彻底杀灭肿瘤细胞,为了增强治疗效果,本研究第二部分进行了光热疗法联合化疗治疗骨转移肿瘤的实验。结果证实MWNTs/Dox介导的光热疗法联合化疗对骨转移肿瘤治疗效果优于单纯光热治疗或是单纯化疗,且联合治疗具有良好的生物安全性。碳纳米管介导的光热疗法联合化疗在治疗骨转移肿瘤领域拥有具有巨大的应用前景。

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