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食管癌组织中△Np73和p73在转录水平的表达状况及相关性研究

【摘要】:目的: p73基因是p53基因家族新成员,在结构和功能上与p53基因具有高度相似性,可以抑制细胞的过度增殖,促进细胞的凋亡,被认为是继p53基因之后发现的重大肿瘤抑制基因。然而研究发现p73基因在人类肿瘤组织中经常呈现高表达状态而极少突变,表明p73不是经典的Knudson型抑癌基因。国内外研究重点转移到p73基因是否存在相关基因的调控及功能抑制方面。最近研究发现缺失氨基端转录激活域的p73的剪接异构体ΔNp73,可以对p53及p73的功能进行负性调节,与人类肿瘤的发生发展关系密切,从而倍受关注。食管癌的发生发展是一个复杂的、多步骤的、进行性的发展过程,涉及多种基因的调控作用。食管癌的确切发病原因目前尚不明确。本研究从转录水平检测分析ΔNp73和p73在食管癌组织中的表达状况及二者的相关性,试从分子生物学角度初步探讨ΔNp73基因及p73基因在食管癌发生发展过程中的意义。 方法:本研究组织标本取自河北医科大学第四医院胸外科2003年3月~2003年8月住院的34例食管癌患者的手术切除癌组织及正常食管组织(手术标本上切缘,距肿瘤边缘5cm)。全部病例术前均未行放射性核素治疗及化学药物治疗。经过肿瘤病理组织学证实,均为食管鳞状细胞癌。其中男性26例,女性8例。肿瘤临床病理分期(国际TNM分期 WP=4 UICC,1997):Ⅰ、Ⅱ期17例,Ⅲ、Ⅳ期17例。标本于术中离体半小时内取材,立即置入液氮速冻,并保存于-80℃冰箱备用。从癌组织标本中提取总RNA,并通过电泳和紫外线分光光度仪鉴定总RNA的完整性及纯度。对总RNA定量后进行逆转录PCR扩增。ΔNp73基因的引物序列为:正义引物P1: 5’- CGC CTA CCA TGC TGT ACG TC -3’; 反义引物P2: 5’- GTG CTG GAC TGC TGG AAA GT -3’。热循环条件为:37℃反转录60分钟;94℃ 5分钟灭活逆转录酶;94℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸40秒,35个循环后72℃延伸7分钟。p73基因的引物序列为:正义引物P1: 5’- CGA CGG CTG CAG AGC GAG -3’; 反义引物P2: 5’-TCG AAG GTG GAG CTG GGT TG -3’。热循环条件为:37℃反转录60分钟;94℃ 5分钟灭活逆转录酶;94℃变性30秒,59℃退火30秒,72℃延伸40秒,35个循环后72℃延伸7分钟。β-actin作为内参照。反应完毕离心后保存。最后对RT-PCR扩增产物进行电泳分离,应用凝胶成像系统观察电泳DNA条带,并使用凝胶成像分析软件对结果进行相对定量分析。以mRNA指数(RI)作为表达水平参数,即p73RI=p73mRNA/β-actinmRNA;ΔNp73RI=ΔNp73mRNA/β-actinmRNA。所有结果应用SPSS 11.0版统计软件分析处理,采用t检验,方差分析,卡方检验,Fisher精确检验及直线回归与相关分析。以P0.05有统计学意义。 结果:1. ΔNp73mRNA在食管癌及正常食管组织中的表达:34例食管癌组织中有18例(53%)ΔNp73mRNA表达阳性;而相对应的正常食管组织中仅有3例(9%)表达阳性。表达阳性的癌组织的ΔNp73的 RI值为1.01±0.24,而对应 WP=5 正常食管组织的ΔNp73的RI值为0.58±0.11。癌组织的阳性表达率及表达水平的RI值均明显高于正常食管组织,两者在统计学存在非常显著的差异(P0.01)。2. ΔNp73mRNA与食管癌临床病理特征的关系:Ⅰ、Ⅱ期食管癌患者与Ⅲ、Ⅳ期食管癌患者的食管癌组织中ΔNp73mRNA的表达水平分别为0.86±0.13和1.21±0.22,经统计学处理两者存在非常显著的差异( P0.01)。但是其表达水平与患者的性别、有无淋巴结转移、临床病理分期、临床病理类型及癌细胞的分化程度等因素无关(P0.05)。3. p73mRNA在食管癌及正常食管组织中的表达:34例食管癌组织中有19例(56%)p73mRNA表达阳性;而相应的正常食管组织中仅有4例(12%)表达阳性。表达阳性的癌组织的p73的RI值为1.02±0.23,而正常食管组织的p73的RI值为0.63±0.13。癌组织的阳性表达率及表达水平的校正值均明显高于正常食管组织,两者在统计学存在非常显著的差异(P0.01)。4. p73mRNA与食管癌临床病理特征的关系:Ⅰ、Ⅱ期食管癌患者与Ⅲ、Ⅳ期食管癌患者的食管癌组织中p73mRNA的表达水平分别为0.88±0.10和1.18±0.24,经统计学处理两者存在非常显著的差异( P0.01)。但是其表达水平与患者的性别、有无淋巴结转移、临床病理分期、临床病理类型及癌细胞的分化程度等同样无关(P0.05)。5. ΔNp73与p73在转录水平表达量的相关分析:在基因转录水平,两者呈现正相关关系(0r1,P0.01)。 结论:在转录水平,食管癌组织中ΔNp73与p73的表达水平均明显高于相对应的正常食管组织。它们的表达水平与食管癌的临床病理分期相关,但是与其它临床病理特征(包 WP=6 括患者性别、年龄、吸烟史、家族史、肿瘤大小、有无淋巴结转移、病理类型、肿瘤部位及癌细胞的分化程度)无关。而且食管癌组织中,ΔNp73与p73在转录水平的表达水平呈现正相关关系,而没有出现量的负反馈;可能两者仅存在功能上的负反馈调节。ΔNp73基因与p73基因可能与食管癌的发生发展有关。

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