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蛇床子素对AD大鼠学习记忆的影响及机制研究

【摘要】:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是发生于老年期和老年前期的一种以进行性痴呆为特征的脑慢性退行性疾病,临床主要表现为记忆力减退、智能障碍及行为情绪等的异常改变。统计表明,65岁左右的老年人中AD发病率为10%,85岁以上的老年人中发病率为47%,AD患者的存活期预计可达到20年,但大多数病例在确诊后仅能存活8~10年,它已经成为人类的第四号杀手。随着人口老龄化进程加快,开发对AD有效的干预措施和治疗药物已成为AD研究的热点,也是一个倍受关注的社会问题。 AD的发病机制一般包括胆碱功能降低,氧化应激,淀粉样肽的级联反应,炎症介质,甾体类激素减少。另外兴奋性毒性、细胞凋亡(apoptosis)、细胞周期调节异常也与AD关系密切。神经生化学揭示中枢氨基酸类神经递质与学习和记忆密切相关,Asp和Glu属于兴奋性氨基酸,Gly和GABA属于抑制性氨基酸,它们对维持神经系统的兴奋和抑制平衡起重要作用。AD时中枢各种氨基酸水平发生变化,尤其Glu和GABA间的平衡被破坏,是导致神经元损伤的关键因素。细胞凋亡是AD发生神经元退行性死亡的重要途径,因此干扰细胞凋亡可能成为治疗AD新方法。细胞凋亡受多种基因的调控,Bcl-2基因家族是很重要的调控基因,包括众多成员,其中Bax在凋亡中起促进作用,Bcl-2则拮抗细胞凋亡。Bcl-2/Bax组成一个平衡体系,Bax过剩细胞凋亡加速,Bcl-2过多则细胞凋亡被抑制。近年来,随着对细胞周期及其调控研究的深入,人们发现AD发病机制与细胞周期调控密切相关,提出了AD发病机制细胞周期假说:一旦细胞周期调控的某一环节出现异常,成年人中枢神经系统的神经元可再次进入细胞周期,但处在有丝分裂末期企图重新进入细胞周期的神经元将出现细胞周期停滞,最终形成AD某种病理特征或神经元凋亡。 蛇床子素(osthole,Ost),7-甲氧基-8-异戊烯基-香豆素,传统中药蛇床子的组成成分,具有多种的药理作用,包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗血小板、雌激素样和抗疼痛等作用,目前已在临床上用于治疗皮肤病和性病多年。我们多年来一直从事蛇床子素改善学习记忆,抗衰老的研究,目前研究表明蛇床子素能通过抑制脑内乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)活性、增强谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性而清除氧自由基(oxygen free radical,OFR),改善痴呆模型小鼠学习记忆障碍,且毒副作用小,能透过血脑屏障(blood-brain barrier,BBB),有望成为预防和治疗AD的有效药物。 基于以上研究背景,本研究采用行为学实验和电生理学实验的方法,研究蛇床子素对Aβ25-35诱导AD大鼠认知障碍及中枢可塑性的影响;采用柱前衍生化高效液相色谱紫外检测法研究蛇床子素对Aβ25-35诱导的AD大鼠海马中氨基酸类神经递质水平变化;采用HE染色、TUNEL染色、免疫组织化学染色方法和流式细胞技术研究蛇床子素对Aβ25-35诱导的AD大鼠海马神经元凋亡、凋亡相关蛋白表达及细胞周期的影响。具体内容如下:1蛇床子素对AD大鼠学习记忆的影响 目的:采用一次性侧脑室注射聚集态Aβ_(25-35)建立AD大鼠模型,并以不同剂量的蛇床子素进行干预,观察蛇床子素对AD模型大鼠认知障碍的影响。 方法:SD大鼠随机分4组:生理盐水对照组(control group),模型组(model group),蛇床子素12.5mg·kg~(~(-1))组(Ost1group),蛇床子素25.0mg·kg~(-1)组(Ost2group)。实验d1,模型组和蛇床子素组大鼠侧脑室注射聚集态Aβ25-35建立AD大鼠模型,对照组大鼠注射生理盐水。造模后对照组和模型组大鼠腹腔注射(peritoneal injection,ip)溶剂1mL·kg~(-1),蛇床子素组大鼠分别给予不同剂量蛇床子素,所有动物都连续给药14d。造模后d10-d14进行Morris水迷宫(morris water maze,MWM)实验,大鼠训练4d(d1-d4),记录动物找到站台的时间(逃避潜伏期)。最后一天训练后24h(d5),移走站台进行测试实验,记录大鼠在目标象限停留时间和穿过站台位点的次数。 结果:随着训练天数的增加,各实验组潜伏期均不断缩短;d1各组间潜伏期相比无差异;模型组与对照组相比,潜伏期从实验d2起延长,目标象限搜寻时间百分率和穿过站台次数减少;蛇床子素组与模型组相比,d2起潜伏期明显缩短,目标象限搜寻时间百分率和穿过站台次数增加。 小结:一次性侧脑室注射聚集态Aβ_(25-35),成功建立AD大鼠模型,出现空间学习记忆能力减退,蛇床子素具有改善AD大鼠学习记忆障碍的作用。2蛇床子素对AD大鼠海马HFS诱导LTP的影响 目的:采用一次性侧脑室注射聚集态Aβ_(25-35)建立AD大鼠模型,并以不同剂量的蛇床子素进行干预,观察蛇床子素对AD模型大鼠中枢突触可塑性的影响。 方法:大鼠造模d14,参照Pellegrino大鼠脑立体定位图谱中的定位方法定位刺激电极和记录电极,采用在体细胞外记录LTP的电生理学方法,观察蛇床子素对AD大鼠海马高频刺激(high-frequency stimulation,HFS)诱导的长时程增强(long-term potentiation, LTP)现象的影响。 结果:各组在给予HFS后,PS幅值在观察的60min内明显增加,并形成LTP现象,但每组HFS后PS幅值增长的幅度不同;与对照组相比,模型组在HFS后60min内各时间点PS幅值减少;而蛇床子素治疗组较模型组PS幅值在高频刺激后的每个时间点升高。 小结:AD模型大鼠海马出现HFS诱导LTP抑制,蛇床子素增强海马神经元的突触可塑性,逆转AD大鼠海马HFS诱导LTP的抑制,从细胞突触水平表明蛇床子素具有改善AD大鼠学习记忆障碍的作用。3蛇床子素对AD大鼠海马氨基酸水平的影响 目的:观察AD大鼠海马氨基酸类神经递质水平变化,从中枢Glu/GABA学习记忆调节系统探讨蛇床子素改善AD大鼠学习记忆障碍的作用机制。 方法:大鼠造模d14,采用柱前衍生化高效液相色谱法测定Asp, Glu,Gly和GABA含量,紫外检测波长是360nm。麻醉状态下脱臼处死大鼠,立即冰上分离海马并用甲醇和水(体积比1:1)制成10%匀浆,4℃离心10min (10000rpm),留存上清在-80℃冰箱用于测定氨基酸含量。测定前将标本复溶,以10000rpm低温高速离心10min,取上清200μL;加入200μL乙腈,混匀,10000rpm低温高速离心10min,沉淀蛋白;取上清液+200μL碳酸氢钠+100μL2,4-二硝基氟苯(DNFB),混匀;水浴60℃,暗中衍生1h;过滤后进样20μL,测定氨基酸含量。 结果:与对照组比较,模型组大鼠海马中Asp、Glu、Gly和GABA含量及Glu/GABA比值显著升高,4种氨基酸中谷氨酸升高最为明显;与模型组比较,蛇床子素各剂量组Glu含量显著降低,Asp、Gly和GABA含量下降,但不具有统计学意义,蛇床子素各剂量组Glu/GABA比值较模型组显著降低,但都高于对照组。 小结:一次性侧脑室注射Aβ_(25–35)建立AD大鼠模型,可导致大鼠海马内氨基酸类递质代谢紊乱,尤其是Glu水平和Glu/GABA比值显著升高,这将导致兴奋性毒性。蛇床子素可通过影响Glu/GABA学习记忆调控系统而抑制Glu的兴奋性毒性,对中枢神经元具有保护作用。 4蛇床子素对AD大鼠海马神经元凋亡的影响 目的:采用一次性侧脑室注射聚集态Aβ_(25-35)建立AD大鼠模型,并以不同剂量的蛇床子素进行干预,观察蛇床子素对AD大鼠海马细胞凋亡、凋亡相关蛋白表达及细胞周期的影响。 方法:大鼠造模d14麻醉,肝素化生理盐水及4%多聚甲醛进行心脏灌注固定30min,快速断头取脑,切成厚度约3mm的组织块,4%多聚甲醛固定24h。然后进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片,分别进行苏木素-伊红染色、Bcl-2和Bax蛋白免疫组化法染色、TUNEL法染色。在光镜下观察切片并记录结果。另一部分大鼠在造模后d14断头处死取海马组织,制备单细胞悬液,70%预冷乙醇固定,4℃放置24h以上。50μg·mL~(-1)碘化丙啶液4℃衍生30min,流式细胞仪分析细胞周期。 结果:①HE染色:对照组光镜下未见有明显病理改变;模型组海马神经细胞排列紊乱,部分神经细胞出现凋亡征象,视野内可见凋亡细胞;蛇床子素组海马结构接近对照组,凋亡细胞较模型组明显减少。②TUNEL法检测凋亡细胞:对照组极少见凋亡细胞;模型组视野内凋亡细胞与对照组比较明显增多;蛇床子素组与模型组比较,凋亡细胞数减少。③Bcl-2、Bax蛋白免疫组化法检测:对照组有极少量Bcl-2、Bax蛋白表达,与对照组比较,模型组Bcl-2,Bax蛋白表达都升高,Bax蛋白表达升高幅度更大,因此Bcl-2/Bax蛋白比值降低。蛇床子素组与模型组比较,Bcl-2蛋白表达增多,Bax蛋白表达减少,Bcl-2/Bax蛋白比值升高。④流式细胞仪检测细胞周期:模型组与对照组比较,模型组G_0/G_1期百分率升高,S期百分率降低,G_2/M期百分率升高,增值指数(proliferation index,PI)降低。蛇床子素治疗组与模型组比较,S期百分率和PI均显著升高,而G_2/M期百分率降低。 小结:蛇床子素调节AD大鼠海马凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax,升高Bcl-2/Bax蛋白比值,具有抗凋亡、保护海马神经元的作用。另外蛇床子素增加S期细胞百分率,促进G_2/M期细胞进一步分裂,增强细胞增殖活性,调节细胞周期,有利于维持海马正常的生理功能。 结论: 1本研究采用一次性侧脑室注射聚集态Aβ25-35,成功建立AD大鼠模型。模型大鼠出现AD征象:学习记忆能力减退;HFS诱导海马LTP的PS幅值降低;海马凋亡细胞增多;海马细胞增殖活性下降,细胞阻滞在G_2/M期;海马内Glu水平及Glu/GABA比值升高,产生兴奋性毒性。 2蛇床子素改善AD大鼠学习记忆障碍,增强海马神经元的突触可塑性,从整体动物水平(行为学)及细胞突触水平(海马LTP)表明蛇床子素具有改善AD大鼠认知障碍的作用。 3蛇床子素降低AD大鼠海马内Glu水平及Glu/GABA比值,调节Glu/GABA学习记忆调控系统,减弱Glu的兴奋性毒性,可能是其改善AD大鼠学习记忆障碍的作用机制之一。 4蛇床子素通过调节AD大鼠海马凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax,升高Bcl-2/Bax蛋白比值,具有抗凋亡、保护海马神经元的作用,可能是其改善AD大鼠学习记忆障碍的作用机制之一。 5蛇床子素通过增加AD大鼠海马S期细胞百分率,促进G2/M期细胞进一步分裂,增强细胞增殖活性,调节细胞周期,有利于维持海马正常的生理功能,可能是其改善AD大鼠学习记忆障碍的作用机制之一。

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