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铜钴硫纳米酶的抗细菌感染作用及机制的研究

【摘要】:背景:细菌感染是一个全球性的健康问题,严重威胁人类的生命。细菌感染通常采用抗生素进行治疗,但抗生素的滥用引发了细菌耐药性问题,导致治疗效果变差,感染相关的死亡率上升。而且,细菌在生命体或非生命体表面倾向于形成细菌生物膜,使抗菌药物难以渗透充分杀菌,而未完全清除的细菌以及生物膜会导致持续性感染而难以根治。因此,开发具有抗生素的作用同时能避免细菌产生耐药性的抗菌材料至关重要。具有模拟酶功能的纳米材料,即纳米酶的发现,为防治细菌感染提供了崭新的思路和方法。纳米酶不仅具有稳定性高、成本低、可大规模生产等优点,还具有丰富的模拟天然酶的催化活性。其中,能够促进活性氧产生的纳米酶备受关注,在抗菌、肿瘤治疗、免疫检测等生物医用领域都具有广泛的应用前景。基于上述研究背景,我们开发了一种铜钴硫(CuCo2S4)纳米酶,同时将双金属纳米酶CuCo2S4与CuS和CoS两种单金属纳米酶进行比较,对它们的形貌、粒径、结构、拟酶活性和催化抗菌效果进行了详细评价。考察CuCo2S4纳米酶催化低浓度H2O2产生活性氧的能力,评价两者协同作用对多种细菌以及细菌生物膜生长的抑制情况,探讨了其抗菌机制,并最终采用小鼠的烫伤伤口感染模型评价了其对细菌感染的治疗效果。目的:本论文中通过溶剂热法制备葡聚糖修饰的CuCo2S4纳米酶。为了更好的说明由双金属构建的纳米酶对过氧化物酶活性的提升作用,我们以同样方法合成的CuS和CoS单金属纳米酶为对照,系统地研究了 CuCo2S4纳米酶的形态、粒径、过氧化物模拟酶活性等性能。随后,通过体外抑菌实验以及对烫伤感染伤口的治疗验证了铜钴硫纳米酶的催化治疗效果,为对抗细菌感染提供一种新的思路和方法。方法:第一章铜钴硫纳米酶的制备及表征在本章中,首先采用溶剂热法制备了不同分子量的葡聚糖修饰的铜钴硫(CuCo2S4)纳米酶。随后通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜对其形貌和尺寸进行表征,X射线衍射仪和高分辨透射电子显微镜分析其晶体结构,通过红外光谱、能谱分析和X射线光电子能谱分析其元素组成。同时,我们采用相同条件制备了 CuS和CoS纳米颗粒作为参照,利用透射电子显微镜观察了它们的形貌,通过X射线衍射仪和X射线光电子能谱分析其晶体结构和元素组成。然后,测试了 CuCo2S4,CuS和CoS纳米酶的过氧化物模拟酶活性,通过分析酶促反应动力学的参数比较了它们的过氧化物酶模拟酶活性。最后,通过亚甲基蓝褪色和电子顺磁共振波谱研究CuCo2S4纳米酶促进活性氧产生的能力。第二章铜钴硫纳米混悬剂的抗菌和抗生物膜效果及对烫伤感染的治疗效果评估基于对CuCo2S4,CuS和CoS纳米酶的过氧化物酶活性详细的分析和比较的结果,在本章中,我们制备了 CuCo2S4纳米混悬剂,考察了 CuCo2S4纳米混悬剂的抗菌性能以及对细菌感染的治疗效果。首先,我们利用革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa),革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resisant Staphylococcus aureus,MRSA)作为抑菌实验的目标对象,测试了CuCo2S4纳米混悬剂在不同pH环境中的抗菌性能。其次我们对比分析了 CuCo2S4,CuS和CoS纳米混悬剂催化H2O2对E.coli,S.aureus以及耐药菌株MRSA的抑制效果。然后在对细菌的形态、内部结构和氧化还原水平进一步分析观察后,探究了 CuCo2S4纳米酶催化抗菌的机制。最后,考察了 CuCo2S4纳米混悬剂对MRSA生物膜的抑制作用,并建立了小鼠烫伤感染MRSA的动物模型,将含CuCo2S4纳米混悬剂和低浓度H2O2涂抹于伤口处进行治疗,观察伤口的愈合情况,并对皮肤伤口进行病理分析。结果:第一章:本章所制得的CuCo2S4纳米酶为大小均匀、粒径约30nm、结晶性良好的纳米颗粒。通过能谱分析发现,CuCo2S4纳米颗粒主要含有Cu、Co、S元素,以及源自葡聚糖的C和O元素,红外光谱分析结果证明CuCo2S4纳米颗粒表面有葡聚糖的存在。XPS的分析结果表明,CuCo2S4纳米颗粒中的铜和钴呈现混合价态,这有利于加速酶催化过程的氧化还原反应的发生。同时,利用相同方法制得的CuS和CoS纳米酶分别为大小约40nm的纳米颗粒和80nm的片层,XRD结果显示CuS和CoS纳米颗粒的结晶性良好。CuCo2S4纳米酶的过氧化物模拟酶活性明显优于CuS和CoS纳米酶,表明铜和钴双金属元素的构成有利于酶活性的提升。同时,实验结果表明CuCo2S4纳米酶在中性pH中的过氧化物酶活性远远高于酸性环境。最后,在对CuCo2S4纳米酶促进自由基产生的研究中,我们发现CuCo2S4纳米酶在中性条件下催化过氧化氢产生的羟基自由基的强度远远高于酸性环境中。第二章:本章研究了由CuCo2S4纳米酶制备的纳米混悬剂的杀菌作用。首先,CuCo2S4纳米混悬剂对革兰氏阴性菌(E.coli和 P.aeruginosa)和革兰氏阳性菌(S.aureus)以及耐药菌株(MRSA)均在中性pH环境中表现出了最优的抑制效果。在中性pH环境中,与CuS和CoS纳米酶对比,CuCo2S4纳米酶则表现了出更加显著的催化杀菌效果,这与它相对更高效的过氧化物酶拟酶活性有关。随后,在CuCo2S4纳米酶抑菌机制的研究中,我们发现CuCo2S4纳米酶的作用使细菌内ROS水平升高,脂质过氧化和DNA降解,细胞壁/细胞膜变形破裂,最终导致细菌死亡。最后,我们的研究结果表明,CuCo2S4纳米酶在中性条件下能够明显抑制MRSA生物膜的生长。在治疗小鼠烫伤感染的研究中,实验结果显示CuCo2S4纳米混悬剂能够有效促进细菌感染伤口的愈合。

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