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低成本聚合物电泳芯片的制作、表面改性及其在食品分析中的应用

【摘要】:微流控以其试样消耗小、检测速度快、便于集成化的特点在食品安全、环境污染物监测、细胞分析等领域得到广泛应用。但是常用的玻璃芯片价格昂贵,批量生产成本过高,高分子聚合物材料虽然价格低廉,但其表面疏水性较强,且对蛋白质等物质存在严重的非特异性吸附作用,在一定程度上限制了微流控技术在实际工作中的应用。此外,离线衍生所需时间往往过长,与微流控技术的分析速度不匹配也是限制其应用的因素之一。因此,探索新型的低成本芯片制作和表面改性技术,建立实用的微流控分析方法仍然是目前迫切需要解决的问题。本论文主要围绕低成本电泳芯片的制作、表面改性及芯片实际应用三个方面展开,内容包括不同材料和微通道构型芯片的制作、表面改性和评价、芯片电泳方案优化、芯片在线衍生以及在食品安全分析方面的应用。主要的创新工作包括:(1)改进了简单的弯曲及蛇形微通道热压加工方法,利用所制作的微通道进行电泳分离,并测试了这些微通道用作微反应器实现复杂化学反应的可能性。(2)尝试采用聚氯乙烯(PVC)制作电泳芯片,证明在两性缓冲添加剂存在下聚氯乙烯芯片非常适合电泳分离。(3)在环烯烃聚合物表面通过光化学改性引入两种不同电荷单体,成功制作具有抗吸附性能的两性离子表面,通过改变单体比例可有效调节表面等电点。(4)建立了一种快速鉴定酱油质量的芯片电泳方法,根据所得的电泳谱图可以判断酱油中所含氨基酸的总量和分布,定量获得胱氨酸的含量,推测酱油中是否含有毛发水解物。(5)设计制作了新型具有在线衍生功能的电泳芯片,成功实现了五种醛类的在线衍生及电泳分离,并将该芯片应用于食品中醛类物质的检测。论文共分为六章:第一章:总结了微流控芯片系统常用材料的性能及其制作过程、常用芯片表面改性技术的原理与方法、样品前处理步骤及芯片电泳系统的原理及常用检测手段。说明了本论文的选题依据。第二章:改进了利用金属丝制作弯曲长微通道芯片的方法,在载玻片上固定胶膜,可以有效解决铜丝在盘制过程中的固定问题。热压后即可获得长度为14 cm的弯形长通道芯片,该方法制作芯片有效减小了手工制作误差及数据的不重复性。考察了这种方法制备的弯道内径为4 mm、5 mm、10 mm三种芯片的电泳分离柱效,发现随着弯道内径的增大,弯道效应所带来的柱效损失逐渐减小。在通道长度仅有14 cm,弯道内径为10 mm的芯片上,可分离十四种氨基酸。使用不锈钢阳模制备了长度达51 cm的密集蛇形通道,用于醛类化合物的ANTS衍生反应,结果发现,所制备的微型反应器可成功用于该衍生反应,通过两种醛类不同的加入顺序,结合LIF检测,可由出峰数量及位置快速判断反应路线。第三章:研究了利用热压法制作PVC材料芯片的基本流程,考察了不同温度对于芯片表面划痕修复及芯片荧光性质的影响,最终确定热压温度为170℃,封接温度为100℃考察了封接时间对通道尺寸的影响,由于PVC芯片压片温度与封接温度相差较大,将封接时间由5 min延长至25 min,微通道尺寸仅减小5μm,封接成功率明显改善。使用羟丙基纤维素对PVC基片进行表面改性,接触角由74.5°降至30.2°,亲水性明显增强。将ATRP方法合成的两性高分子聚合物作为添加剂,PVC芯片对氨基酸和蛋白质均表现出良好的分离性能。第四章:在聚环烯烃COC芯片表面成功通过紫外光接枝两种丙烯酸类单体,即丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵和2-甲基-2-[(1-氧代-2-丙烯基)氨基]-1-丙磺酸钠盐,从而形成两性离子改性层。通过此方法,只要改变表面引发单体的种类及两性离子单体的比例即可有效的调控表面电荷。通过接触角测定、X射线光电子能谱及红外光谱对双单体改性表面进行了表征。结果表明,两种单体被成功接枝在COC表面,接触角由改性前的75.0°降至33.0-44.3°,证明改性后其亲水性明显增加。通过调节不同单体比例(3:7、5:5、7:3),证明等电点可在3至9之间变化。将改性后的芯片用于电泳分离,有效证明了改性层表面电荷的均一性。通过荧光显微镜及流动电势证明了该两性离子表面对蛋白质分子具有显著的抗吸附性能。利用这种方法改性芯片还被成功应用于全血凝血时间的测定。第五章:针对市面上存在毛发水解液调制劣质酱油的现象,建立了一种快速鉴定酱油中氨基酸总量和及其分布的芯片电泳方法。该方法可以在60 s内得到异硫氰酸荧光素(FITC)快速衍生的酱油样品中各类氨基酸的特征分布谱图。利用测得的胱氨酸含量,可确定样品是否有可能含毛发水解液。四种酱油样品中胱氨酸的加标回收率为97.2-116.0%,峰面积的RSD在0.64-4.45%。与传统的滴定总氮量氨基酸测定方法相比,该法速度快、而且可以确定氨基酸的类别,是一种简单快捷的酱油质量鉴别方法。第六章:设计制作了一种新型双螺旋在线衍生电泳检测集成芯片。该芯片双螺旋通道可有效提高混合效率并完成多步衍生反应。通过液面压力差驱动实现醛类在螺旋通道内的还原胺化反应,并通过激光诱导荧光检测对反应结果进行表征。结果发现,在所制备的集成芯片上,五种醛类(香兰醛、肉桂醛、苯甲醛、大茴香醛、糠醛)可被在线快速衍生,完成芯片电泳测定。对比传统加热衍生手段,芯片衍生不仅有利于提高反应速率,还可避免衍生过程中的副产物。该芯片独特的结构有效保证了进样过程的重复性,连续三十次进样峰面积标准偏差仅为0.28.1.61%。该芯片被成功应用于巧克力和婴儿米粉中醛类香料的检测,加标回收率为87.8-102.8%。

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