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整合多组学数据解析miRNA在大麦盐胁迫响应和籽粒发育过程中的作用

【摘要】:microRNA(miRNA)是一类非编码小RNA分子,其以碱基互补配对方式与基因mRNA结合,介导靶基因降解或抑制翻译,进而参与基因表达调控,在植物生长、发育、逆境响应等过程中起着重要作用。大麦(Hordeumvulgare)是世界上第四大禾本科作物,同时也是最耐盐的作物之一,广泛种植于干旱、半干旱地区,应用于人类食物、动物饲料和啤酒酿造。随着新一代高通量测序技术的发展和相关生物信息学分析手段的提高,整合多组学数据(如小RNA测序、转录组、降解组等)为解析miRNA在大麦生长发育及逆境响应过程中的作用带来了新的机遇。本研究采用多组学数据相结合的策略,一方面,比较分析大麦盐胁迫响应及籽粒发育过程中的关键miRNAs及其调控靶基因,另一方面,系统分析野生大麦miRNAs,从miRNA角度比较分析野生大麦和栽培大麦间异同。本研究结果可丰富大麦miRNA数据,并揭示miRNA在大麦逆境响应、生长发育及进化过程中的作用。主要研究结果如下:(1)大麦盐胁迫相关miRNA的鉴定与功能分析我们以大麦栽培品种Morex为研究材料,取盐胁迫(100mM)处理后3h、8h和27h及相应对照组样品,分别构建6个小RNA文库和1个降解组测序文库,然后,利用IlluminaHiseq2000测序平台进行高通量测序。数据分析共鉴定到152个miRNAs,包括28个大麦knownmiRNAs、114个同源miRNAs和10个novelmiRNAs,隶属于126个miRNAs家族。其中,44个miRNAs在盐胁迫条件下显著差异表达,隶属于39个miRNA家族,并且分别有14、4和11个miRNA家族为植物保守性、禾本科保守性和大麦盐胁迫特异性表达。与对照组相比,绝大部分盐胁迫响应相关miRNAs在盐胁迫处理8h后表现为显著上调表达,而在3h和27h时表现为下调表达。随后,结合降解组测序和生物信息学,我们对所有盐胁迫相关miRNAs靶基因进行系统分析,结果发现分别有86和37个参与新陈代谢和逆境响应相关基因受到大麦盐胁迫响应相关miRNAs的调控,这些基因在盐胁迫条件下主要表现为抑制植物生长和降低代谢活动。最后,我们利用qRT-PCR对部分miRNAs及其靶基因表达模式进行比较分析。综上所述,至少有39个miRNA家族及其调控的123个靶基因参与大麦苗期早期盐胁迫响应,这些结果可为进一步解析大麦耐盐机制提供参考。(2)利用高通量测序技术鉴定野生大麦miRNAs及其靶基因野生大麦是栽培大麦的祖先种,其也是大麦遗传改良的重要基因库。在本研究中,我们选用野生大麦MtGilboabarley3-25为材料,分别提取其不同发育阶段根、茎、叶和穗等组织的总RNA,然后等量混合RNA并构建小RNA文库。高通量测序共获得9885815条cleanreads,经过数据分析,最终鉴定到55个knownmiRNAs、14个novelvariants和18个novelmiRNAs。序列分析发现,本研究鉴定到的所有野生大麦miRNAs在4个大麦栽培品种中均具有高度保守性前体序列,尤其是在成熟miRNA区间,表明miRNAs功能上的重要性决定其在大麦不同品系间高度保守。随后,我们比较分析了14个novelvariants和18个novelmiRNAs在栽培大麦中的表达情况,结果发现21个miRNAs在栽培大麦morex中表达,包括7个novelvariants和14个novelmiRNAs,并且绝大部分表达miRNAs在栽培大麦和野生大麦间显著差异表达(95.24%,20/21),表明栽培大麦和野生大麦间表型变异可能大部分来源于miRNAs的差异表达,而非基因组miRNAs组成。靶基因分析发现,有12个miRNA家族介导调控转录因子,包括8个植物保守性和4个wheat-barley保守性miRNA家族。此外,其它靶基因主要参与各种生理、代谢及逆境响应等过程。本研究首次在野生大麦中分析miRNAs,可为解析miRNAs在野生大麦中的调控作用提供参考。(3)整合mRNA和小RNA表达分析解析大麦籽粒发育大麦是研究禾本科作物籽粒发育的重要模式材料,在本研究中,我们结合转录组和小RNA高通量测序,比较分析大麦籽粒发育过程中基因和小RNAs的动态表达变化,包括籽粒发育4个重要阶段:早期物质存储前期准备阶段(stage01:0-5DPA,开花后0-5天),晚期物质存储前期准备阶段或过渡阶段(stage02:6-10DPA)、早期物质存储阶段(stage03:11-15DPA)和levelsoff阶段(stage04:16-20DPA)。转录组数据分析发现,在大麦籽粒发育过程中,初级和次级代谢相关基因表达活性均发生了显著变化,并且转录活性变化与生理变化相一致,即随着大麦籽粒的成熟,基因表达活性逐渐降低,变化最剧烈的时间出现在晚期物质存储前期准备阶段(stage02)向早期物质存储阶段(stage03)过渡时,并且ABA和糖信号转导在阶段转换中起着重要作用。另外,籽粒自身光合作用相关基因表达最活跃时期出现在stage01和stage02,且主要参与脂肪代谢和核苷酸代谢,而非碳水化合物合成。整合小RNAs数据分析发现,绝大部分miRNAs表达最活跃时期出现在基因表达最不活跃(stage04)和最活跃时期(stage01),而siRNAs主要在基因最不活跃时期(stage03和stage04)表达活性最高,表明在大麦籽粒发育过程中,miRNAs可能主要扮演着“regulator”的角色,其通过介导基因表达调控参与各种新陈代谢过程,而siRNAs主要扮演着“silencer”的角色,主要负责抑制基因活性,直至种子休眠。此外,我们鉴定到8908基因与大麦籽粒发育相关,包括298个时期特异性表达和8610个显著差异表达基因,其中,分别有131和1695个基因受miRNAs和siRNAs调控。本研究可为解析小RNAs介导的基因表达调控在大麦籽粒发育过程中的作用提供重要信息,也为大麦及其它禾本科作物籽粒相关性状遗传改良提供参考。

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