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自动化分离唾液外泌体用于食管癌诊断研究

【摘要】:唾液外泌体是发掘新型癌症早期诊断生物标志物的潜在来源。目前分离唾液外泌体最常用的超速离心法(Ultracentrifugation,UC)和聚乙烯二醇沉淀法(Polyethylene glycol precipitation,PEG)需要大体积样本、耗时并且无法去除唾液淀粉酶和白蛋白等高丰度蛋白,导致无法从唾液样品中分离出高纯度、高产量的外泌体,不能满足蛋白质组学的研究。为了解决这一问题,本文采用了基于负压振荡技术(Negative pressure oscillation technology,NPOT)的无标签外泌体自动纯化系统(Label-free exosome automatic purification system,LEAPS),建立了一种高效高纯地从唾液中分离外泌体的新工艺和新技术。该系统由一个自动控制平台和一个带有两个平行纳米多孔膜的微流控芯片组成,可实现自动化非标记地分离纯化唾液外泌体。基于该系统,本论文主要做了以下几方面的研究:(1)通过LEAPS技术,对唾液外泌体分离条件(分离负压、转换时间和洗涤次数)进行优化。研究表明,在负压为30 kPa、转换时间为10 s和洗涤次数为2次的条件下,LEAPS能够在40 min内从1 mL唾液中迅速分离纯化外泌体。(2)与UC和PEG方法相比,LEAPS技术将分离时间分别缩短了 6倍和24倍,外泌体的产量分别提高了 2倍和1.5倍,外泌体的纯度分别提高了 12倍和60倍,RNA产量分别提高了 10倍和5倍。此外,通过LEAPS可以有效去除唾液中高丰度蛋白(例如唾液淀粉酶和白蛋白)的影响。蛋白质组学分析结果显示,LEAPS分离的外泌体携带更多的外泌体标志物,这表明LEAPS在基于唾液外泌体的生物分子研究上具有更大的价值。(3)采用LEAPS技术对健康人和食管癌患者的唾液样本进行分离研究。结果发现,在食管癌患者唾液蛋白浓度远高于健康人的情况下,通过LEAPS分离的食管癌患者和健康人的唾液外泌体在分离时间,粒子浓度或粒径大小等方面无显著差异。蛋白免疫印迹结果显示,食管癌患者和健康人的唾液外泌体均表达CD81、CD9、CD63等外泌体特异性蛋白。TMT(Tandem Mass Tags)蛋白质组学结果显示,在健康对照组和食管癌组的外泌体中共检测出658种蛋白,其中差异表达蛋白共105种。因此,基于LEAPS的唾液外泌体分离对于发现唾液中的外泌体生物标志物并用于癌症诊断具有重要的潜力。

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