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    Ngn3过表达对诱导人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响

    孔吟皓  
    【摘要】:目的:探讨神经元素3(neurogenin3,Ngn3)的过表达能否促进人脐带间充质干细胞(human umbilical-cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)向胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells,IPCs)的诱导分化。方法:分离培养hUCMSCs,通过流式细胞术鉴定CD90,CD105,CD45,CD34的表达情况,通过成脂、成骨诱导分化鉴定细胞的多向分化潜能。使用分阶段联合诱导法诱导hUCMSCs分化为IPCs,诱导过程包括10天的低糖诱导(含EGF)和11天的高糖诱导(含激活素A和尼克酰胺)。在此基础上,分别尝试在不同时间感染Ngn3过表达慢病毒载体,确定最佳感染时间;按照确定的时间,在分阶段联合诱导过程中感染病毒,Western blot法检测Ngn3过表达情况。同时进行分阶段诱导和Ngn3过表达的诱导细胞作为实验组,仅进行分阶段诱导的细胞作为对照组。21天诱导完成后,透射电镜观察诱导前后两组细胞的结构变化;收集两组细胞的mRNA和蛋白质,通过Real-Time PCR和Western blot法比较诱导后两组细胞的胰岛素和MafA表达情况;收集培养上清液,ELISA法测定C肽分泌量。结果:成功分离hUCMSCs,细胞具有成脂、成骨分化潜能,细胞高表达CD90、CD105,低表达CD34、CD45。通过分阶段联合诱导法成功将hUCMSCs诱导为IPCs。在诱导开始前过表达Ngn3细胞出现凋亡;在诱导的第1周末,病毒载体进入细胞且Ngn3成功过表达,细胞活性稳定(该组确定为实验组);在诱导第2周末病毒载体感染失败。电镜观察实验组诱导细胞结构较对照组更为成熟;Real-Time PCR和Western blot结果显示实验组细胞阳性表达胰岛素和MafA且表达量明显高于对照组;ELISA结果显示实验组细胞在诱导中后期C肽分泌量一直略高于对照组且在诱导21天出现明显上升。结论:在分阶段诱导第1周末感染Ngn3过表达慢病毒,可促进hUCMSCs向IPCs的诱导分化。


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