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    甲基苯丙胺对SH-SY5Y细胞凋亡及Parkin介导的线粒体自噬的影响

    王琪  
    【摘要】:目的:观察甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)对体外培养的人神经母细胞瘤细胞(Human neuroblastoma cells,SH-SY5Y细胞)的形态、凋亡水平、线粒体超微结构和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成量的影响;观察PINK1/Parkin介导的线粒体自噬水平,并追踪自噬流进程,以探讨METH诱导在体外培养的SH-SY5Y细胞损伤的作用机制,为METH所致的神经毒性的预防和治疗提供科研依据。方法:建立METH诱导体外培养SH-SY5Y实验模型,分为对照组、1.0 mmol.L~(-1)、1.5 mmol.L~(-1)和2.0 mmol.L~(-1)METH组,作用24 h后,以流式细胞术检测SH-SY5Y细胞凋亡水平、活性氧生成水平;透射电镜下观察SH-SY5Y细胞超微结构及线粒体自噬现象,计数线粒体数量;激光共聚焦显微镜下观察SH-SY5Y细胞溶酶体吞噬线粒体活性水平;蛋白免疫印迹法(Western boltting,WB)检测自噬调节蛋白PINK1和Parkin表达水平、自噬标志蛋白LC3-II/LC3-I的比值和特异性自噬受体蛋白P62表达水平。结果:与对照组比较,SH-SY5Y细胞凋亡率随着METH处理浓度的升高依次增加了42%、88%和140%,且与METH的处理浓度呈正相关(P0.05);SH-SY5Y细胞内实时ROS水平升高,与对照组相比,DCFH-DA探针的平均荧光强度分别提升99%、178%和239%,与METH处理浓度呈正相关(P0.05);透射电镜下,METH处理SH-SY5Y细胞的内质网、高尔基体扩张,线粒体嵴肿胀断裂,形态上由正常杆状变为小球状,部分视野出现自噬小体;高浓度处理组线粒体数量较对照组减少51.8%(P0.01);激光共聚焦显微镜下观察METH处理组SH-SY5Y细胞线粒体溶酶体共定位面积增大,与对照组比,溶酶体线粒体之比依次增大了13.1%,34.2%,55.2%,溶酶体吞噬线粒体活性随处理浓度升高而增强(P0.05);随着METH处理浓度的升高,体外培养的SH-SY5Y细胞自噬调节蛋白Parkin蛋白表达量升高,与对照组比,依次增加了为81.5%、111.1%和190.7%(P0.05);PINK1蛋白表达量无明显变化;自噬标志蛋白LC3-II/LC3-I比值呈增大趋势,与对照组比,其比值依次增大了40.8%、121.4%和202.3%(P0.05);培养24h,P62蛋白表达水平不变;培养48 h后,与对照组比,P62蛋白表达量依次降低了37%、62.9%和81.4%(P0.05)。结论:METH可诱导体外培养的SH-SY5Y细胞凋亡,并破坏细胞的超微结构,尤其对线粒体等膜性细胞器损伤严重;METH致体外培养的SH-SY5Y细胞毒性,可能与METH诱导的高氧化应激和线粒体功能紊乱相关;METH可通过诱导Parkin过表达介导线粒体自噬(以清除受损线粒体),其自噬流通畅,自噬流未端的反馈迟滞,可能与细胞凋亡有关。


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