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    Notch1信号通路调节触液神经元增殖能力的研究

    何宇祺  
    【摘要】:目的:探讨Notch1信号通路在介导触液神经元增殖中的作用。方法:1、提取出生24h内C57BL/6小鼠高位颈髓中央管区周围神经组织,经流式细胞分选技术分选、纯化触液神经元;2、观察体外悬浮培养的触液神经元成球情况,并连续传代。免疫荧光检测神经球是否表达神经干细胞标志物;3、通过EDU检测试剂盒、CCK-8检测试剂盒、免疫荧光标记增殖标志物Ki67三种方法检测第3代触液神经元所形成的神经球增殖能力;4、Western Blot检测触液神经元中Notch1信号通路表达情况;5、在体外悬浮培养的触液神经元分为4组,A组为对照组:无血清神经培养液;B组为DMSO组:无血清神经培养液+0.05%DMSO;C组为DAPT组:无血清神经培养液+50μmol/L DAPT(用0.05%DMSO配置);D组为Jagged-1组:无血清神经培养液+5μmol/L Jagged-1。通过EDU检测试剂盒、CCK-8检测试剂盒、免疫荧光标记增殖标志物Ki67三种方法检测4组触液神经元所形成的神经球增殖能力。结果:1、经流式分选后的触液神经元纯度为(94.5±2.03)%,存活率为(93.82±2.58)%;2、免疫荧光证实神经球高表达触液神经元标志物PKD2L1,并且与神经干细胞标记物Nestin、Sox2,细胞增殖相关标记物Ki67共表达。神经球进行EDU染色,阳性细胞率为(42.32±1.80)%。CCK-8染色后第96h与第120h之间OD值无明显统计学差异(P=0.44),其余各组时间点间OD值均有统计学差异(P0.05)。表明触液神经元所形成的神经球具有神经干细胞特性及良好的增殖能力。3、神经球标本提取蛋白行Western Blot检测,检测到Notch1、NICD、Hes1蛋白的表达,表明触液神经元中存在Notch1信号通路。4、在触液神经元所形成的神经球细胞中加入Jagged-1,发现Notch1、NICD、Hes1蛋白表达量较对照组升高(P_(Notch1)0.01,P_(NICD)0.01,P_(Hes1)0.01),表明Jagged-1可激活Notch1信号通路。CCK-8检测72h、96h、120h时,Jagged-1组细胞OD值与对照组细胞相比明显升高(P_(72h)=0.03,P_(96h)=0.02,P_(120h)=0.01);免疫荧光发现Jagged-1组细胞Ki67蛋白A.U.值较对照组比明显升高(P0.01);EDU检测发现Jagged-1组阳性细胞率较对照组比明显升高(P0.01)。表明Jagged-1可增强触液神经元的增殖能力。5、在触液神经元所形成的神经球细胞中加入DAPT,发现Notch1、NICD、Hes1蛋白表达量较对照组减低(P_(Notch1)0.01,P_(NICD)0.01,P_(Hes1)0.01),表明DAPT可抑制Notch1信号通路。CCK-8检测72h、96h、120h时,DAPT组细胞OD值与对照组细胞相比明显降低(P_(72h)0.01;P_(96h)0.01;P_(120h)0.01);免疫荧光发现DAPT组细胞Ki67蛋白A.U.值较对照组比明显降低(P0.01);EDU检测发现DAPT组阳性细胞率较对照组比明显降低(P0.01)。表明DAPT可降低触液神经元的增殖能力。结论:1、触液神经元在体外具有神经干细胞潜能;2、触液神经元中表达Notch1蛋白;3、激活Notch1信号通路可增强触液神经元的增殖能力,沉默Notch1信号通路可降低触液神经元的增殖能力。


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