BNIP1经mTOR通路对宫颈癌细胞增殖和侵袭的影响

【摘要】：目的:分析BCL2和腺病毒E1B 19-k Da相互作用蛋白1(BCL2 and adenovirus E1B 19-k Da-interacting proteins 1,BNIP1)在不同时期的宫颈癌患者和正常人群组织中的表达差异。了解在不同宫颈癌细胞系(包括C-33a,Caski,He La,Si Ha和C4-1细胞)中BNIP1的表达水平差异。研究BNIP1在He La细胞增殖、迁移和侵袭中所起的作用。方法:1、通过收集76例已确诊的宫颈癌患者的临床资料,通过蛋白印迹试验(Western blotting,WB)了解相应宫颈癌病理组织中BNIP1相对表达水平。2、选取非肿瘤组织(n=30),I B1期+I B2期(n=34),I B3期(n=22)和II A期(n=20)宫颈癌组织,通过荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative PCR Detecting,q RT-PCR)和WB试验来分析其中BNIP1的表达水平差异。3、进行q RT-PCR和WB试验来测试BNIP1在不同细胞系(包括C-33a,Caski,He La,Si Ha和C4-1细胞系)中的相对表达水平,并选取其中中等表达的细胞系用于后续实验。4、利用分子克隆技术构建靶向BNIP1基因的重组质粒(BNIP1-si RNA)及其阴性对照质粒(si RNA-NC),通过Lipofectamine TM 2000将特异性靶向BNIP1 m RNA序列的重组质?；蚨哉罩柿Ｗ镜紿e La细胞中。5、通过细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8),细胞迁移侵袭试验(Transwell)和流式细胞术分别测定经过不同分组处理的He La细胞的增殖,迁移,侵袭和凋亡能力。6、用q RT-PCR和WB试验评估经过不同分组处理的He La细胞中的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR),p70S6K1和p-p70S6K1的表达水平。结果:1、BNIP1在宫颈癌组织中低表达,且与宫颈癌的临床病理学特征密切相关,其与淋巴结转移情况(p=0.0008)、肌层浸润深度(p=0.0007)、肿瘤分期(p=0.0005)及肿瘤直径(p=0.0010)呈负相关,但与其分化程度(p=0.4851)及脉管内有无瘤栓(p=0.2953)的关系无统计学意义。2、通过对不同宫颈癌细胞系进行q RT-PCR及WB试验,BNIP1在C-33a和Caski细胞表达水平较高,而在Si Ha和C4-1细胞中表达水平较低,He La细胞的BNIP1表达水平居中。3、通过不同分组条件对He La细胞进行处理后,BNIP1的表达水平越高,其对应的He La细胞的增殖,迁移和侵袭能力将会降低,而凋亡的He La细胞数目会增多。4、通过进行q RT-PCR及WB试验,BNIP1高表达水平组中m TOR,p70S6K1和p-p70S6K1表达水平被明显降低,相反,在BNIP1低表达水平组中m TOR,p70S6K1和p-p70S6K1表达水平均升高。5、通过分别使用m TOR激活剂及抑制剂处理He La细胞,m TOR激活剂处理能够阻止由BNIP1介导的对He La细胞的抑制作用,而m TOR抑制剂起相反作用。结论:BNIP1表达水平与宫颈癌的分期、肿瘤大小、肌层浸润及是否发生淋巴结转移相关;宫颈癌进展程度越高BNIP1表达水平越低,不同宫颈癌细胞系的BNIP1表达水平具有差异;BNIP1通过抑制m TOR信号通路从而抑制He La细胞的增殖、迁移和侵袭能力,同时促进其凋亡。