氧化苦参碱干预砷致肝纤维化中细胞自噬的研究

【摘要】：目的:探讨氧化苦参碱(OM)干预砷(As)致肝纤维化过程中细胞自噬的作用。方法:1.体内实验:SD大鼠,随机分为对照组、染砷组、低剂量OM干预组、高剂量OM干预组,每组8只。染砷组、低剂量OM干预组、高剂量OM干预组大鼠给予5 mg/kg的亚砷酸钠水溶液对灌胃,一周连续染毒6天,间隙一天,染砷20周;然后低剂量OM干预组和高剂量OM干预组的动物分别给予8周氧化苦参碱(剂量分别为25mg/kg、50mg/kg)灌胃干预治疗;实验结束后杀鼠,取血及肝脏;全自动生化分析仪检测大鼠血清中天冬氨酸氨基转移酶(AST),丙氨酸氨基转移酶(ALT)的含量;HE染色观察大鼠肝组织;Western Blot检测大鼠肝脏组织自噬相关蛋白自噬相关基因12(ATG12)、自噬相关基因5(ATG5)、促进微管相关蛋白质1轻链3(LC3Ⅱ)表达水平。2.体外实验:本实验使用100μmol/L亚砷酸钠染毒人胎肝细胞株LO2 24h,检测AST、ALT水平,待出现明显肝细胞损伤,收取培养上清。将染砷LO2培养上清与正常培养液按照1:4比例混合后培养人肝星状细胞株LX2 24 h后,采用低(0.25mg/ml)、高(1mg/ml)剂量氧化苦参碱加入培养体系,共干预24h;全自动生化分析仪检测染砷LO2培养上清中AST、ALT的含量;MTT检测LX2细胞增殖率;Western Blot检测LX2活化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),自噬相关蛋白ATG12、ATG5、LC3Ⅱ,内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、磷酸化蛋白激酶样内质网激酶(p-PERK)、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)表达水平;流式细胞仪检测LX2细胞凋亡率、细胞周期;油红O染色观察LX2细胞内脂滴。结果:1.体内实验:(1)染砷组大鼠血清AST、ALT含量较对照组显著上调(P0.05),HE染色可见大鼠肝脏肝小叶结构异常,可见大量肝细胞空泡样变,散在炎性细胞浸润,肝小叶间可见纤维组织增生。经低、高剂量氧化苦参碱干预后,血清AST、ALT含量显著下调(P0.05),病理切片观察到炎性细胞浸润以及纤维增生减少。(2)染砷大鼠较对照组ATG12、ATG5、LC3Ⅱ表达水平显著上调(P0.05),低、高剂量OM干预染砷的肝纤维化大鼠后,ATG12、ATG5、LC3Ⅱ表达水平显著下调(P0.05)。2.体外实验:(1)100μmol/L Na As O_2毒染LO2细胞24h后,培养上清中ALT、AST水平显著高于对照组(P0.05),将其与正常培养液混合后培养LX2细胞,细胞增殖率和α-SMA表达均显著上调(P0.05),细胞内脂滴减少,G1期细胞比例显著降低(P0.01)。(2)间接染砷LX2细胞较对照组GRP78、p-PERK、CHOP、ATG12、ATG5、LC3Ⅱ表达水平显著上调(P0.05)。(3)氧化苦参碱可以抑制间接染砷LX2增殖(P0.05),低、高剂量氧化苦参碱干预间接染砷LX2细胞,α-SMA、GRP78、p-PERK、CHOP、ATG12、ATG5、LC3Ⅱ表达水平显著下调(P0.05),细胞内脂滴增加,发生G1期细胞阻滞。结论:1.氧化苦参碱干预可以改善染砷诱导的大鼠肝纤维化,其机制与细胞自噬有关。2.染砷致肝纤维化与染砷后肝细胞损伤致肝星状细胞活化有关,细胞自噬和内质网应激PERK-e IF2α信号通路活化参与了染砷间接活化肝星状细胞这一过程。3.氧化苦参碱干预此过程可能与细胞自噬调脂滴代谢和细胞周期有关。