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3-MA与PD-1抑制剂在协同治疗不同错配修复基因型结肠癌的作用研究

【摘要】:背景:PD-1/PD-L1抑制剂的免疫疗法已显示出良好的临床疗效,并已被FDA批准用于许多癌症。然而在应用于治疗晚期结直肠癌的过程中,仅仅3.5%~5%的d MMR-m CRC患者获得良好的疗效;与d MMR-m CRC相比,免疫疗法对庞大的p MMR-m CRC人群(95%)疗效甚微。因此,如何提高p MMR-m CRC患者的临床疗效并延长生存期,成为亟待解决的临床问题。自噬是将细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解的过程,自噬在肿瘤中也扮演着双重角色,抑制细胞癌变和促进肿瘤生长。与d MMR-m CRC相比,p MMR-m CRC肿瘤细胞具有更高的自噬活性,我们推测p MMR-m CRC肿瘤的高自噬活性是影响PD-1抑制剂疗效甚微的原因;虽然有研究显示封锁免疫检查点PD-1/PD-L1和不同MMR型CRC有密切联系,但是确定不同MMR型CRC免疫治疗与细胞自噬导致耐药的研究尚未报道。所以,本课题通过自噬抑制剂与PD-1抑制剂的联合应用,以探究抑制自噬是否可以提高PD-1抑制剂对p MMR-m CRC的疗效,克服免疫治疗的原发耐药,并明确p MMR-m CRC细胞自噬与PD-1抑制剂耐药的机制具有重要意义。本课题旨在探究自噬抑制剂3-MA和PD-1抑制剂联合用药后抑制敲除了Mlh1基因的鼠源结直肠癌细胞CT26在体内外的增殖的协同增效作用和可能分子机制,联合治疗可能是克服PD-1抑制剂耐药的可行策略,可为改善p MMR-m CRC患者的治疗疗效及预后提供一种新的解决方法。方法:(1)在自然状态无错配修复基因缺失基因型鼠源CT26细胞,本实验通过CRISPR-Cas9技术敲除CT26中的Mlh1基因,成功构建了CT26-d MMR基因型细胞株供本实验后续试验研究。(2)本实验在体外通过RT-PCR、Western blot和流式细胞术等探究Akt激动剂及3-MA(自噬抑制剂)和TNF-α(在体外模拟PD-1抑制剂的作用)单独或联合处理CT26-p MMR和CT26-d MMR细胞的细胞周期、自噬和凋亡相关基因和蛋白质的表达水平,了解抑制细胞自噬与PD-1抑制剂给药后,d MMR和p MMR型CRC疗效的差异性。(3)动物实验选择CT26-p MMR和CT26-d MMR细胞接种于Bal b/c正常小鼠构建CDX动物模型,检测3-MA联合PD-1抑制剂对不同MMR基因类型的CT26细胞皮下荷瘤小鼠肿瘤生长抑制作用和对免疫细胞的影响。随机分为四组,A组:溶剂对照组(NC),B组:3-MA单药组,C组:PD-1抑制剂单药组,D组:3-MA+PD-1抑制剂联合给药组。待肿瘤体积约为1500-2000 mm~3时,处死荷瘤小鼠。小鼠内脏器官进行HE染色评估两药治疗的安全性;对肿瘤组织进行IHC检测Ki-67、CD3、CD8、LC3、PD-L1蛋白和TUNEL评估肿瘤组织的增殖、T细胞浸润和凋亡情况。结果:(1)Western blot检测Mlh1蛋白在CT26细胞中不表达,表明CT26中的Mlh1基因被敲除,成功构建了鼠源d MMR细胞株(CT26-d MMR)。(2)MTT法检测3-MA和TNF-α处理不同MMR基因类型的CT26细胞48 h后,表明3-MA和TNF-α以浓度和时间依赖性方式抑制不同MMR基因类型的CT26细胞增殖,3-MA和TNF-α作用48 h后IC_(50)=1 m M和IC_(50)=10 ng/m L,两药联合药物指数EOB值也表明3-MA和TNF-α在不同MMR基因类型的CT26细胞中表现为协同抑制作用,所以本试验选择3-MA(IC_(50)=1 m M)和TNF-α(IC_(50)=10 ng/m L)进行后续体外实验。(3)通过流式细胞术检测细胞周期和Western blot试验,表明TNF-α联用3-MA可以阻断Cyclin D1的表达而阻滞细胞周期,继而阻滞细胞增殖。(4)RT-PCR和Western blot检测自噬相关基因及蛋白的表达,表明TNF-α可促进细胞自噬水平增加,p MMR细胞较d MMR细胞高自噬活性且p MMR与d MMR有差异显著性(LC3,p0.0001);免疫荧光和透射电子显微镜观察细胞自噬活性,表明NC组p MMR细胞较d MMR细胞自噬水平高,TNF-α可促进细胞自噬,TNF-α联用3-MA后下调自噬相关基因和蛋白的表达水平,可降低分别单用3-MA或TNF-α干预所产生的p MMR与d MMR细胞表达差异程度。(5)流式细胞术Annexin V-APC/PI凋亡检测结果显示CT26两细胞经3-MA联合TNF-α处理后,细胞凋亡率较TNF-α显著升高(p0.0001);RT-PCR和Western blot试验结果,表明TNF-α联用3-MA比单用TNF-α更能促进细胞凋亡,诱导Cleaved Caspase 3和Cleaved Caspase 9表达水平显著上调(p0.001),并且使CT26-p MMR细胞凋亡程度与CT26-d MMR细胞相类似。(6)动物体内试验结果,发现PD-1抑制剂对CT26-p MMR与CT26-d MMR小鼠单独给药抑瘤率为48.75%和69.64%,3-MA+PD-1抑制剂联合给药抑瘤率为89.88%和90.41%。HE染色检测小鼠的内脏器官未观察到病理学改变,且两药联合组小鼠体重未发生明显变化,证明两药单用或联合给药均具有较高的安全性。IHC检测小鼠的肿瘤组织,TUNEL中显示PD-1抑制剂联用3-MA组比单用PD-1抑制剂明显促进肿瘤凋亡;PD-1抑制剂联用3-MA明显比PD-1抑制剂单用更能上调Ki67,CD3,CD8和PD-L1蛋白在p MMR和d MMR中表达,下调LC3表达。(7)流式检测免疫细胞结果表明:PD-1抑制剂联用3-MA组(p MMR:0.623±0.055%,d MMR:0.373±0.265%,p0.001)比单用PD-1抑制剂(p MMR:0.737±0.102%,d MMR:0.563±0.176%,p0.001)使Treg的数目显著降低(p0.01);PD-1抑制剂联用3-MA组(p MMR:35.367±13.294%、d MMR:41.4±3.34%)比单用PD-1抑制剂(p MMR:28.267±4.6%、d MMR:28.333±9.674%)显著增加CD3~+T(p0.01);PD-1抑制剂联用3-MA组(p MMR:6.54±2.46%,d MMR:8.29±0.95%)比单用PD-1抑制剂(p MMR:4.67±1.76%、d MMR:8.75±0.46%)显著增加CD8~+T(p0.05)。结论:本课题成功构建了非自然状态的d MMR CT26鼠源细胞,通过研究结果表明自噬抑制剂与PD-1抑制剂的联合用药可协调增效促进p MMR CT26肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤的增殖,逆转CT26-p MMR对PD-1抑制剂免疫治疗的原发耐药。这为探究应用PD-1抑制剂治疗原发耐药提供了新的思路,并为逆转其他p MMR类型实体瘤原发对免疫检查点疗法耐药的难治性问题提供一种新的解决方法。

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