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家蚕缩蚕突变体突变基因的功能研究

【摘要】:昆虫是无脊椎动物中节肢动物门昆虫纲的动物,它是最繁盛的动物。昆虫之所以是世界上数量最多的动物物种,这与其行为惊人的适应能力是密不可分的。昆虫的热耐受力是昆虫对环境适应性的一个重要生理特性。热的耐受性已在多个昆虫报道,比如:蝗虫、粉虱、甲虫、蛾、蚂蚁、果蝇和黄蜂。然而,耐热的分子机制仍不是很明确。本文选取了家蚕温度敏感型突变体缩蚕(contraction, cot)为研究对象,该突变是家蚕少有的行为突变体之一。缩蚕突变由单基因控制,呈隐性遗传,突变基因cot被定位于第15连锁群的25.0位点。缩蚕幼虫表型为幼虫身体粗短,手碰触后即强度收缩,翻倒,吐消化液,一时不能行动。本文通过对缩蚕突变体的行为进行全面的观察,锁定了突变体的突变基因,并利用转录组测序的方法,分析了该突变对其它代谢通路的影响。获得的主要研究结果如下: 1.缩蚕突变体的行为观察 为了探明缩蚕突变性状的诱发原因,本研究分别利用机械刺激和高温处理两种方法进行突变性状诱导。实验结果表明:在常温下用棉签反复摩擦刺激5龄第5天不同基因型(cot/cot,cot/+和+/+)个体,仅基因型为cot/cot的蚕体出现微弱体节收缩,但刺激结束后又迅速恢复正常,未能诱发其突变性状的产生;cot (cot/cot)品种30℃处理5min,部分个体产生胸部膨大和体节缩短的表型;35℃处理5min后,所有个体产生体节严重缩短、胸部膨大、身体翻滚、吐液,且部分个体会暂时丧失行动能力。cot/+品种则在45℃处理时,虽然也产生缩蚕表型,但其表型比基因型为cot/cot个体弱,10min处理后全部产生缩蚕表型。正常型Dazao (WT,+/+)即使在52℃处理10mmin也没有产生收缩的表型。结果表明:cot/cot和cot/+基因型个体对温度的敏感度不同,因此,可以利用高温处理的方法鉴别cot/cot和cot/+基因型个体;同时由于cot/+基因型个体在45℃处理时产生缩蚕的表型,也表明该突变为不完全显性突变体。研究还发现,利用温度差鉴定的方法处理缩蚕cot (cot/cot)蚁蚕期、幼虫期(5龄第3天)、蛹期和成虫期的个体都产生明显的缩蚕表型。另外,基因型为cot/cot个体高温处理后基本丧失爬行能力,相反正常型Dazao (+/+)受到温度刺激后,其爬行行为变的十分活跃。这些结果表明,cot的突变性状主要由温度诱导产生。因此,cot是一种对温热敏感的突变材料,是一个研究昆虫对环境温热做出快速反应的良好材料。 同时,我们还发现:25℃时,cot/cot ok/ok和+/+ok/ok两个基因型个体每分钟心跳次数分别为56.15和54.05;42℃处理3min后,cot/cot ok/ok和+/+ok/ok两个基因型个体每分钟心跳次数增加为86.6和67.25,存在显著差异,表明高温处理后cot/cot ok/ok个体心率显著增加。 2.缩蚕突变体的定位克隆 为了从分子水平研究缩蚕突变性状的发生,本研究利用定位克隆方法对cot基因进行了分离克隆。本研究以cot纯合突变(cot/cot,♂)和正常型Dazao(+/+,♀)为母本,杂交获得F1代(cot/cot♀×+/+♂)。利用高温处理的方法从回交个体中鉴别缩蚕突变表型和正常表型个体共计1255个,其中正常表型个体418个和缩蚕突变个体837个。并将这1255个正常表型个体和突变表型个体用于后续定位分析。通过初定位和精细定位锁定缩蚕的突变区域为SNP19和SNP25,物理距离为268kb的区域,该区域内包含10个预测基因,分别为:BGIBMGA007797、BGIBMGA007730.BGIBMGA007796、BGIBMGA007731、BGIBMGA007795、 BGIBMGA007732、BGIBMGA007733、BGIBMGA007734、BGIBMGA007794和BGIBMGA007735。生物信息学分析表明,BGIBMGA007794基因是编码跨膜离子通道蛋白的基因,介导了兴奋性膜的电压依赖性钾离子渗透性,与果蝇的癫痫基因(seizure)高度同源,而且seizure突变体产生类似于cot的表型。我们推测BGIBMGA007794基因可能为缩蚕的突变基因。 3.缩蚕突变基因的突变位点鉴定和功能验证 为了研究是否BGIBMGA007794基因(命名为Bmsei)为引起cot突变的基因,本研究首先从mRNA水平进行PCR检测及测序分析。结果显示:Bmsei的mRNA在cot/cot和cot/+个体中至少存在3种不同的剪切形式。其中,Isoform Ⅰ的第5外显子完全缺失,与正常相比,其mRNA的ORF阅读框在733nt处提前终止,产生截断的蛋白,缺少第4、第5、第6跨膜区、P区及cNBD结构域;Isoform Ⅱ序列第5外显子末端缺少36bp,翻译后的蛋白在第5外显子末端缺少12个氨基酸;Isoform Ⅲ第5外显子末端插入54bp,其OR.F阅读框在853nt处提前终止导致翻译的蛋白缺少P区、第6跨膜区和cNBD结构域。对Bmsei基因组水平PCR检测及测序分析的结果表明:cot品种中Bmsei基因的第5内含子发生了特有的15bp的缺失,推测该缺失导致了mRNA水平的异常剪切。不同组织表达谱显示:Bmsei基因主要在cot/cot和+/+的头、前部丝腺、中部丝腺和神经节中表达。时期表达谱分析表明:Bmsei基因在家蚕胚胎后期、幼虫期、蛹和成虫期持续表达。为了验证Bmsei基因的分子功能,本研究利用钾离子阻断剂研究其对家蚕行为的影响,结果表明,正常型个体的幼虫期和成虫期注射钾离子通道蛋白抑制剂氯化四乙胺(TEA)和氯化钡(BaCl2),都产生和缩蚕品种高温处理后相似表型,暗示缩蚕突变体的突变基因直接或间接与钾离子通道蛋白相关。在胚胎期,通过注射dsRNA干涉降低Bmsei基因的表达量,可以导致正常型Dazao产生头部剧烈摆动和吐肠液的现象,这与缩蚕蚁蚕受到高温刺激后的表型一致。这些结果表明:Bmsei基因为缩蚕的突变基因。选择化蛾第1天的缩蚕蛾子,分别注射不同浓度的庆大霉素。结果显示:随着庆大霉素浓度的增加,缩蚕蛾的翅膀竖立程度越来越弱,并逐渐趋近于水平位置,这与正常型Dazao相似。这些结果表明:随着浓度的增加,庆大霉素可以部分地恢复缩蚕异常的表型。 4.缩蚕突变基因的分子机制初探 通过对正常型(+/+)和突变型(cot/cot)5龄第5天的神经节进行组织免疫荧光分析,结果表明:Bmsei蛋白在正常型(+/+)神经节中表达量很高,而在cot突变体中表达量极低。为了进一步确定该蛋白在神经节中的表达情况,将正常型Dazao的5龄第5天神经节石蜡包埋、切片,检测到Bmsei蛋白在细胞膜和胞质中都有表达。Western blot结果显示:在常温和高温处理条件下,正常型(+/+)、cot/+和cot/cot中在100kD附近检测到两条条带,且两个条带的表达量在cot/+和cot/cot中明显低于+/+;42℃条件下,该蛋白的两条条带在三个品种中都下调表达,其中cot/+和cot/cot品种显著下调,且cot/cot中表达量最低。这些结果表明:Bmsei蛋白合成的异常可能导致缩蚕产生异常表型。 5.家蚕缩蚕突变体的转录组测序及数据分析 为了调查缩蚕高温处理后转录组水平的变化,本研究对构建完成的6个样品的文库进行了测序分析,文库依此命名为:cot(cot/cot ok/ok)42℃、cot(cot/cot ok/ok)25℃、ok(+/+ok/ok)42℃、ok(+/+ok/ok)25℃、Dazao(+/++/+)42℃和Dazao(+/++/+)25℃,并进行测序。比较cot(cot/cot ok/ok)、ok(+/+ok/ok)和Dazao(+/++/+)三个品种42℃5min处理组的样品与未处理组,分别检测到147、221和24个差异表达基因,其中12个基因在oct(cot/cot ok/ok)、 ok(+/+ok/ok)和Dazao(+/++/+)三个品种都差异表达,30个基因在cot(cot/cot ok/ok)和ok(+/+ok/ok两个品种差异表达,19个基因在oct(cot/cot ok/ok)和Dazao(+/++/+)两个品种差异表达。3个品种的蚁蚕在42℃处理5min后,有12个共同的差异基因,其中1个未注释基因显著下调表达,另外11个注释为热激蛋白相关基因且显著上调表达,表明热激蛋白在响应高温应激方面发挥重要的作用。为了鉴定在高温(42℃)条件下,cot品种特有的差异表达基因,我们选择仅在cot品种特有的110个差异基因用于后续分析。差异基因参与泛素体系、烟碱乙酰胆碱受体的差异表达基因、心脏兴奋-收缩偶联过程、Notch信号通路。这些差异基因可能导致cot品种在受到高温(35℃)处理后表现的体节异常收缩及心跳增加的现象。这些差异表达基因和代谢通路为研究昆虫对高温的适应性提供理论参考。

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