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重组人促红细胞生成素对抗视网膜缺血性损伤的实验研究

【摘要】: 视网膜从发生学上来说属于神经系统向前延伸的部分,和脑组织均有相同的组织特点,即富含不饱和脂肪酸,线粒体中有大量的氧化代谢途径,有丰富的血液供应,对于缺血性损伤非常敏感[1]。视网膜缺血是临床上常见的一种综合征,如青光眼、视网膜血管阻塞、糖尿病性视网膜病变,是导致视功能损害的常见原因。许多研究都发现视功能的损害是由缺血后再灌注损伤引起的,由于缺血再灌注损伤的机制还不是很清楚,治疗的药物也还很欠缺目前认为损伤的机制包括能量缺乏、钙离子超载、自由基的大量产生、兴奋毒性氨基酸的过量释放[2][3]、各种神经营养因子的缺乏及由此而启动了调控细胞凋亡的基因,使视网膜神经细胞因凋亡致死[4][5],从而引起视功能的损害。在众多机制中,启动调控细胞凋亡基因是一个关键性枢纽环节。 促红细胞生成素(EPO)一种含唾液酸的酸性热稳定(80℃)糖蛋白,由165个氨基酸组成,相对分子量为34000D(道尔顿),来源于肾脏及胎肝,在缺氧情况下,EPO可在肾外更多的器官中表达[6]。1983年,Lin成功分离并克隆了人EPO,它位于7号染色体长臂22区。1985年利用基因重组技术生产出重组人促红细胞生成素(rhEPO),并广泛应用于临床。 近年来许多研究表明,EPO具有神经营养活性,Bocker-Meffert[7]等在生后小鼠视网膜组织培养时分别加入EPO,血管内皮细胞生长因子(VEGF),它们呈剂量依赖方式促进视网膜神经节细胞轴突的生长,当将EPOR的抗体加入培养基后其促轴突生长的作用被抑制。缺乏EPO-R的鼠10.5d时脑发育受到影响,神经祖细胞减少,凋亡增加,鼠脑细胞发生明显凋亡[8],同时Siren[9]等的研究也显示,经腹腔注射rhEPO可使脑梗死面积缩小75%[9].对于视网膜而言,EPO能否同样起到对抗视网膜缺血性损伤作用,观察其对视网膜缺血时神经元的凋亡和caspase-3蛋白表达的影响,以及对视网膜功能的影响,探讨EPO的保护作用及其保护机制,正是本次实验所要研究的课题. 目的 本实验是通过建立兔急性视网膜缺血模型,监测闪光视网膜电图(FERG)b波波幅的变化,用TUNE法计数视网膜切片中凋亡细胞的数量;比较石蜡切片视网膜的形态结构变化,对实验各组进行caspase-3蛋白免疫组化染色,观察各组间的差异,研究EPO在视网膜缺血性损伤中的保护作用以及探索其保护作用的机制。 方法: 1.动物模型制备参考[10]和Naomichi Katai[11]造模方法,用眼内穿刺灌注压力为110mmHg (14.6kpa )使眼内压升高,维持2h,造成视网膜急性缺血动物模型, EPO组和生理盐水组分别在缺血后5分钟给注射rhEPO(1000U/kg)和等量生理盐水腹腔注射[10]。 2.ERG b波的监测: 健康的新西兰大白兔12只,随机分为2组,分别为生理盐水组、EPO治疗组, 12只兔在造模前30 min和造模后第12h、24h、72h分别进行视网膜电图(electroretinogram,ERG)检查。 3.视网膜组织病理切片 健康的新西兰大白兔28只,随机分为正常组,生理盐水组和EPO治疗组,每组4只兔子,(后两组又分为造模后12h、24h、72h三组),共7组,各组按各时间点摘取眼球,常规制成石蜡切片进行HE染色,于不同时间点在光镜下观察EPO组与生理盐水组视网膜的形态结构变化。 4.TUNEL法检测视网膜凋亡细胞 将各组按时间点摘取眼球固定后,沿眼球矢状面作连续石蜡切片,片厚5μm,用TUENL方法做细胞凋亡检测,了解视网膜细胞的凋亡情况,并在高倍镜下进行TUNEL阳性细胞计数后进行统计学分析。 5. caspase-3免疫组化检测 将各组按时间点摘取眼球固定后,沿眼球矢状面作连续石蜡切片,片厚5um,用免疫组化SABC法,观察视网膜内caspase-3蛋白的表达,在高倍镜下对阳性细胞进行计数后进行统计学分析。 结果: 1.ERG观察结果: ERGb波振幅在视网膜缺血损伤后检测第12h时的波幅比较低,与缺血前基线值比较有显著性差异(P0.01)。以后随着时间的延长其振幅值逐渐升高,但实验结束时两组振幅值均没有达到基线水平,但EPO治疗组ERG—b波振幅值在各个时间点显著高于生理盐水组(P0.05)。 2.凋亡细胞计数的结果显示正常兔视网膜TUNEL染色阴性,治疗组和生理盐水组都有凋亡细胞的出现,且趋势都是从12h到72h逐渐减少,且治疗组比生理盐水组明显减少。两组凋亡细胞计数有显著性差异(P0.05)。 3.视网膜组织病理切片观察结果 HE染色结果显示治疗组和正常对照组形态、结构、厚度均相似,无明显的变化。而生理盐水组则发生了明显的结构层次紊乱,厚度也发生改变,尤其以内核层和神经节细胞层的变化更为明显。 4. caspase-3免疫组化检测 caspase-3免疫组化检测结果显示正常大鼠视网膜caspase-3染色阴性,而两组再灌注后各个时间段GCL层和ONL可观察到阳性染色,两组24h组阳性染色的细胞最多,同一时间点的阳性细胞数相比较有显著性差异。 结论: 1.EPO可以抑制视网膜缺血性损伤时caspase-3基因蛋白表达的增高,caspase一3表达减少可能是EPO神经保护机制之一。 2.应用EPO能够不完全对抗视网膜缺血性损伤,对视网膜功能的恢复有帮助。 3.在视网膜缺血再灌注损伤中,存在有视网膜细胞的凋亡,EPO能够减少视网膜细胞的凋亡。 4.高眼压模型,是一种研究RIR的损伤的简便有效方法。

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