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基于功能性DNA纳米结构的等温扩增检测方法研究

【摘要】:近年来,随着纳米技术的迅猛发展,DNA作为纳米尺度的柔性材料因其优越的可编程性、易修饰性及功能多样性已被用于构建各种具有不同空间构象的生物分子识别探针,在检验医学及分析化学领域发挥着重要的作用。同时,核酸等温扩增技术是继聚合酶链式反应技术后发展的一类新型核酸体外扩增技术,可以实现靶标分子在恒温条件下的快速、高灵敏扩增。该技术具有操作便捷,无需依赖精密的温控仪器设备等优点,已被广泛应用于各种生物分子靶标物质的体外及细胞内部的检测,并在疾病诊断、细胞原位检测等多个领域发挥重要的作用。本论文整合临床检验诊断学、分析化学以及纳米科学等多学科最新的研究成果,基于DNA纳米结构的可控性及功能性,结合核酸等温扩增技术,发展了一系列蛋白质及核酸检测新方法,为疾病的早期诊断与预后监测提供了新的分析策略,主要包括以下三个部分:1.基于靶标响应的DNA四面体荧光探针用于DNA甲基化转移酶的高灵敏分析DNA纳米结构具有机械性能稳定、分子修饰位点丰富等优点,构建了一种集识别、检测为一体的具有DNA四面体纳米结构的分子探针用于DNA甲基化转移酶的快速荧光检测方法。用于构建DNA四面体纳米结构的单链DNA两端分别修饰了荧光和猝灭基团,当4条单链DNA自组装形成具有三维空间构象的DNA四面体纳米结构时,荧光基团和猝灭基团紧密靠近,导致四面体结构荧光猝灭。在靶标分子DNA甲基化转移酶存在时,可以在37°C的恒温条件下对四面体棱上的特殊位点进行甲基化修饰;随即,限制性内切酶Dpn I识别并催化剪切甲基化修饰后的位点,进而破坏四面体的稳定结构,导致四面体崩塌,荧光基团和猝灭基团分离,最终荧光信号得以恢复。这一反应过程实现了靶标分子触发的DNA四面体从“关闭”到“开启”的荧光信号转换,成功用于DNA甲基化转移酶的荧光检测。基于该检测方法对靶标的检测线性范围为0.1 U/mL至90 U/mL,最低检测限为0.045 U/mL。并且通过特异性实验、回收实验等对该方法的分析性能进行评估,结果表明该方法具有较好的检测特异性和重复性。因此,基于DNA纳米结构发展的DNA四面体检测探针,可以在等温条件下实现DNA甲基化转移酶的灵敏、准确检测,为临床相关疾病的诊断提供了潜在的检测技术方法。2.基于靶向诱导的三交联DNA结构触发双重等温扩增反应的BCR-ABL1融合基因灵敏检测发展了一种基于靶标诱导的三交联DNA纳米结构,在等温条件下通过聚合酶和限制性内切酶的辅助作用产生循环聚合剪切反应及滚环扩增反应,用于BCR-ABL1融合基因的快速、灵敏检测。在这一方法中,基于靶标分子诱导,两条DNA单链识别探针在检测体系中与靶标基因BCR-ABL1通过杂交反应自组装成三交联DNA纳米结构;在此纳米结构形成的基础上,聚合酶及限制性内切酶相互协同并触发第一重的循环聚合剪切反应,产生大量的剪切产物;该剪切产物可以作为触发链触发第二重的滚环扩增反应,实现大量的基于靶标响应的荧光信号输出。通过利用所构建的三交联DNA纳米结构触发的双重等温扩增检测方法对靶标BCR-ABL1融合基因进行检测,其检测线性范围为10 fM到1 nM,且最低检测限为5.52 fM。该方法操作过程简单,仅需一步反应并在60 min内完成检测;并且,该方法在复杂的生物基质环境下实现了对靶标分子的灵敏检测,且结果稳定,重复性好。因此,基于靶标BCR-ABL1融合基因诱导的三交联DNA纳米结构并触发双重等温扩增这一检测策略在白血病的临床诊断和科学研究领域具有潜在的应用价值。3.基于脱氧核酶靶向剪切触发滚环扩增反应的荧光检测方法用于BCR-ABL1融合基因转录水平分析发展了一种基于靶标诱导的脱氧核酶(Deoxyribozyme,DNAzyme)催化剪切并触发滚环扩增反应的等温检测方法用于BCR-ABL1融合基因转录水平的灵敏、准确检测。当靶标存在时,DNAzyme作为识别探针和靶标BCR-ABL1的RNA片段杂交,形成特殊的空间构像,在Mg~(2+)的辅助下,DNAzyme发挥催化剪切作用切割靶标RNA片段,产生断裂产物。随后,经T4多核苷酸激酶(T4 PNK)对断裂产物的3’末端进行修饰后,该产物可以作为环状DNA模板的引物触发下一步的滚环扩增反应。反应结束后,信号探针基于链置换反应可以与扩增产物识别并杂交,产生大量的荧光信号。该方法可以实现对靶标基因BCR-ABL1的灵敏检测,其检测限可低至9.4 fM。并且,使用该方法和逆转录聚合酶链式反应(Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)对12例临床诊断为慢性粒细胞白血病(Chronic myelocytic leukemia,CML)患者的RNA样本进行BCR-ABL1的检测,结果显示两种方法具有很好的相关性,均能很好的衡量BCR-ABL1的转录水平。此外,此方法可以成功应用于CML患者骨髓细胞内BCR-ABL1融合基因的mRNA原位检测,检测结果显示与荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)检测所获得的结果具有一定相关性,表明该方法具有较好的准确性。因此,基于靶标RNA诱导功能性DNAzyme的催化剪切反应并触发的滚环扩增检测方法可以用于BCR-ABL1融合基因转录水平的特异、灵敏检测,该方法的建立为慢性粒细胞白血病的早期、精准诊断提供了新的思路和技术手段。

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