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负性协调刺激分子PD-1通路对原发性难治性癫痫免疫调控的研究

【摘要】:第一部分负性协调刺激分子PD-1在原发性难治性癫痫患者周围性免疫调控中的研究目的原发性难治性癫痫病因不明,危害大,随着发病机理地不断探索,大量证据表明癫痫的发生可能与非神经性改变有关,免疫因素对癫痫的反复发作发挥了至关重要的作用,调节性CD4+CD25high T细胞(T regulatory cells,Treg)和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)目前已成为免疫调节的关键参与者。因此我们着手于PD-1通路与CD4+CD25low和CD4+CD25high Treg细胞的作用研究难治性癫痫的发病机制,力求在该通路中寻找到难治性癫痫的病因和治疗价值。本研究首先通过体外实验探讨PD-1在原发性难治性癫痫部分发作患者、原发性难治性癫痫持续状态患者和健康志愿者外周血中CD4+CD25high和CD4+CD25lowT淋巴细胞的表达、细胞因子的浓度区别,以及外周血中各型Treg细胞数量的差异,以探讨其在原发性难治性癫痫发生及发展中的可能作用。方法本课题组自2015年11月至2017年3月在从我科建立的癫痫患者库中耐药性癫痫患者档案中随机抽取原发性难治性癫痫部分发作患者41例,近期原发性难治性癫痫持续状态住院患者26例作为本次研究的实验组,健康志愿者25例。收集受试者外周血,分离外周血单个核细胞,荧光抗体标记,流式细胞仪检测比较原发性难治性癫痫部分发作、原发性难治性癫痫持续状态患者和健康对照组外周血淋巴细胞、CD4+T细胞、CD4+CD25high和CD4+CD25low Treg细胞表达数量的差异,以及PD-1在CD4+CD25high和CD4+CD25lowTreg淋巴细胞的表达差异,同时使用ELISA方法测定患者外周血中1L-10浓度差异,明确年龄,性别,发作程度以及病程等对上述因素的影响,确定原发性难治性癫痫患者外周血不同亚型调节性T细胞、IL-10及PD-1在调节性T细胞亚群百分含量的差异。结果1、健康对照组、原发性难治性癫痫复杂部分发作组、原发性难治性癫痫持续状态患者组三组间性别、年龄、病程、发作频率以及CD4+CD25low T细胞百分比无显著性差异(P0.05)。2、原发性难治性癫痫部分发作组和癫痫持续状态患者组外周血PD-1+CD4+CD25low和PD1+CD4+CD25high Treg淋巴细胞表达的百分比明显高于对照组,差异均有统计学意义(P0.05);3、原发性难治性癫痫部分发作组和癫痫持续状态患者组外周血淋巴细胞百分比,CD4+T淋巴细胞百分比,CD4+CD25high Treg细胞百分比均明显低于健康对照组,差异均有统计学意义(P0.05);4、癫痫持续状态患者组外周血T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞和CD4+CD25high Treg细胞百分比均明显低于原发性难治性癫痫部分发作组,PD1+CD4+CD25high和PD-1+CD4+CD25low Treg细胞百分比明显高于原发性难治性癫痫部分发作组,差异均有统计学意义(P0.05);5、通过ELISA法,癫痫组血清中IL-10的表达明显高于健康对照组,癫痫持续状态组明显高于部分发作组,差异均有统计学意义(P0.05);6纳入性别、年龄、病程和发作频率与各结果相关性(spearman相关)分析,提示仅癫痫部分发作外周血组随患者年龄PD1+CD4+CD25low T细胞中的百分比、CD4+T细胞的百分比(P2)表达下降,存在相关性(P0.05);健康对照组与癫痫持续发作组的年龄与各结果均无统计学相关性;7对PD1+CD4+CD25high Treg/CD4+CD25highTreg比率进行相关性分析,三组两两比较,提示癫痫患者中上述比率明显增高,且随发作程度增强比率上升,均有统计学差异(P0.05)。结论原发性难治性癫痫不同发作程度组患者PD-1在CD4+CD25high和CD4+CD25low Treg细胞上表达和IL-10浓度都明显升高,同时CD4+T细胞群失调,PD-1+CD4+CD25highTreg/CD4+CD25high Treg比例发生改变。我们的研究结果表明在人类原发性难治性癫痫患者中,PD-1的表达增高很可能与患者体内自身免疫反应过程相关,该路径参与了原发性难治性癫痫病变过程中自身免疫调控。因此我们推测PD-1免疫通路的改变,导致系统性免疫状态和炎性环境的变化,T细胞表型和炎症因子分泌水平紊乱,引起自身免疫,最终导致原发性难治性癫痫的发生发展以及耐药的发生。第二部分负性协调刺激分子PD-1在原发性难治性癫痫患者中枢免疫调控的研究目的脑脊液与脑组织细胞外液直接相连,不同部位脑组织的代谢产物均可分泌进入脑脊液,神经元缺失、损伤以及突触受损、血脑屏障破坏等都会引起脑脊液中蛋白质以及细胞因子等特异性改变。中枢神经系统的细胞免疫反应常仅反映于脑脊液中,脑脊液免疫细胞成分的分析便成为评价中枢神经系统免疫功能的重要途径,因此脑脊液具有重要的临床研究价值。我们通过体外实验测定原发性难治性癫痫患者脑脊液中淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比以及PD-1在Treg淋巴细胞的表达和IL-10的浓度,比较原发性难治性癫痫癫痫持续状态患者和健康志愿者脑脊液中IL-10和PD-1在CD4+CD25high和CD4+CD25lowT淋巴细胞的表达的差异,探讨其在中枢性免疫的作用。方法本课题组自2015年11月至2017年3月在从我科原发性难治性癫痫持续状态住院患者26例作为本次研究的实验组,健康志愿者25例。收集受试者脑脊液,分离脑脊液中单个核细胞,RPMI1640中培养以行T淋巴细胞扩增,免疫荧光标记、流式细胞仪检测并比较原发性难治性癫痫持续状态患者和健康志愿者脑脊液中PD-1在CD4+CD25high和CD4+CD25lowT淋巴细胞的表达,ELISA方法测定脑脊液中IL-10的浓度,明确各实验组PD-1在CD4+CD25high,CD4+CD25low Treg细胞,PD1+CD4+CD25high在CD4+CD25highT细胞的百分比含量的差异,明确年龄,性别和病程等对上述因素的影响,确定并比较原发性难治性癫痫持续状态患者和健康志愿者脑脊液中PD-1、Treg细胞和IL-10间的免疫相关关系。结果1健康对照组、原发性难治性癫痫持续状态患者组两组间性别、年龄、病程、发作频率以及CD4+CD25low T细胞百分比,CD4+T淋巴细胞百分比无显著性差异(P0.05)。2原发性难治性癫痫持续状态患者组脑脊液中PD-1在CD4+CD25low和CD4+CD25high Treg淋巴细胞表达的百分比明显低于对照组,差异均有统计学意义(P0.05);3原发性难治性癫痫持续状态患者组脑脊液中淋巴细胞百分比,PD-1+CD4+CD25high Treg细胞百分比明显高于健康对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。4通过ELISA法,癫痫持续状态组脑脊液中IL-10的表达明显高于健康对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。5 PD1+CD4+CD25high Treg/CD4+CD25high Treg比率进行相关性分析,两组进行比较提示癫痫持续状态组与健康对照组,无统计学差异(P0.05)。结论我们推测原发性难治性癫痫持续状态患者中CD4+CD25+T细胞上其PD-1表达上调后一方面抑制了T细胞的正常增殖,从而CD4+CD25+high Treg的数量减少,另一方面抑制了CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制功能。由于CD4+CD25+Treg数量及功能降低,从而对效应性T细胞的抑制能力不足,进而增强效应T细胞活性,诱导机体发生免疫平衡紊乱,增加免疫病理损伤,导致疾病的发生发展。综上所述,CD4+CD25highTreg数量下降及其表达PD-1分子上调导致进一步降低Treg的免疫抑制活性,可能在原发性难治性癫痫持续状态中枢免疫机制中起了重要作用。第三部分丙戊酸对负性协调刺激分子PD-1在原发性难治性癫痫患者免疫调控的影响及作用目的癫痫的反复发作及慢性病程均导致了免疫状态的改变,免疫介导的癫痫发病机制可能导致了难治性癫痫耐药的可能,丙戊酸可能通过调节树突状细胞的能力来介导不同的T淋巴细胞反应来差异调节炎症,并且它们可以为治疗炎症相关疾病提供互补的免疫调节作用。因此我们通过体外实验确定原发性难治性癫痫持续状态丙戊酸控制发作前后患者外周血中PD-1在CD4+CD25high和CD4+CD25lowTreg淋巴细胞和IL-10的表达差异,比较癫痫持续状态控制前(d0)后(d3)丙戊酸浓度与癫痫控制临床作用间的关系,并探讨其在原发性难治性癫痫治疗过程中的免疫作用。方法本课题组自2015年11月至2017年3月在从我科原发性难治性癫痫持续状态住院患者26例作为本次研究的实验组,健康志愿者25例。使用丙戊酸作为癫痫干预治疗唯一因素,癫痫持续状态控制前(d0)后(d3)不同时段收集受试者外周血和脑脊液,HPLC方法测定外周血及脑脊液中丙戊酸钠血药浓度,免疫荧光标记、流式细胞仪检测PD-1在CD4+CD25high,CD4+CD25low调节性T淋巴细胞数量,PD1+CD4+CD25high/CD4+CD25high Treg细胞比率,ELISA法测定IL-10的血浆浓度,比较丙戊酸干预处理前后上述指标的变化,丙戊酸浓度与临床癫痫治疗的相关性,明确年龄,性别以及病程等对上述因素的影响。结果1.原发性难治性癫痫持续状态患者丙戊酸控制癫痫治疗48h后(d3组)中PD-1+CD4+CD25low和PD-1+CD4+CD25high Treg淋巴细胞表达的百分比,以及CD4+T细胞百分比明显低于癫痫持续状态发作初期24h内(d0组),差异均有统计学意义(P0.05);而CD4+CD25low和CD4+CD25high,淋巴细胞百分比和CD4+T淋巴细胞百分比较d0组明显升高,差异均有统计学意义(P0.05);2.丙戊酸的血药浓度还是脑脊液中药物浓度高低均与癫痫持续状态控制起始时间无明显相关性(P0.05%),血药浓度与脑脊液中药物浓度无相关性,但脑脊液中药物浓度明显低于血药浓度。治疗过程中不同时段(d0与d3)丙戊酸血药浓度无统计性差异;3.丙戊酸可调控原发性难治性癫痫持续状态外周血中的IL-10,d3较d0明显降低(P〈0.05);4.正常组与d0、d0与d3组间PD1+CD4+CD25high/CD4+CD25highT细胞的百分比有明显差异(P〈0.05),正常组与d3无统计学差异(p0.05)。结论我们推测原发性难治性癫痫持续状态发生时患者T细胞的正常增殖受广泛抑制,经积极抗癫痫持续状态治疗后PD-1对CD4+CD25+T细胞发挥免疫无能特性和免疫抑制性降低,CD4+CD25+Treg数量及功能增强,从而抑制了机体发生免疫平衡紊乱,减轻了免疫病理损伤。综上所述,丙戊酸抗癫痫持续状态治疗能提高CD4+CD25high Treg数量,并降低PD-1分子负性调控对Treg的免疫抑制活性,可能在原发性难治性癫痫持续状态患者抗癫痫持续状态治疗中免疫调控起了重要作用。

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