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IL-37通过IL-6/STAT3信号通路抑制HCC细胞侵袭和转移的机制研究

【摘要】:目的:以抗炎性细胞因子IL-37作为研究对象,观察其对HCC细胞侵袭和转移的影响及其可能的分子机制。方法:收集54例肝癌新鲜组织标本,经q PCR和IHC检测癌组织及其对应癌旁组织中IL-37的表达水平,并用spearman秩相关分析、Kaplan-Meier生存曲线分析IL-37表达与肝癌临床病理特征、预后的相关性;qPCR和Western blot检测正常肝细胞系LO2,QSG-7701与肝癌细胞系SMMC-7721,HepG2的IL-37表达水平;构建过表达IL-37的慢病毒载体,并通过DNA测序鉴定其序列正确性;药筛法检测病毒滴度;将慢病毒感染SMMC-7721,HepG2细胞,获得过表达IL-37的稳定细胞株,观察感染后72 h细胞荧光分布,再通过Western blot检测IL-37表达水平;在HCC细胞中过表达IL-37和siRNA沉默IL-37,观察IL-37在体外对HCC细胞侵袭和转移能力的影响;Western blot检测SMMC-7721LV_NC和SMMC-7721LV_IL1F7中IL-6对STAT3,pSTAT3(Y705)的激活情况;Western blot检测IL-6预处理SMMC-7721LV_NC、SMMC-7721LV_IL1F7、HepG2LV_NC、HepG2LV_IL1F7对E-cadherin,MMP2、Vimentin表达的影响;构建裸鼠肺转移瘤模型,观察SMMC-7721LV_NC与SMMC-7721LV_IL1F7肿瘤肺转移瘤数量的差异。结果:在54对HCC组织中有37对(68.52%)IL-37的表达水平低于对应癌旁组织;ihc分析示:il-37在癌组织中较癌旁组织呈低表达,并且有血管侵袭的肿瘤组织中il-37表达水平更低;qpcr结果表明:在伴有门静脉侵犯的hcc组织中,il-37的表达水平显著低于无静脉侵犯hcc组织和正常肝组织;il-37在smmc-7721、hepg2、qsg-7701、lo2细胞中的mrna相对表达水平分别为0.167,0.433,1.143,1.043;il-37的蛋白表达水平也证实了同样趋势;根据ihc的结果,以中位数作为分割线将54例hcc患者分为il-37低表达组(n=27)和il-37高表达组(n=27),il-37的表达水平与hcc患者的血管侵袭(p=0.013)相关;用kaplan-meier法统计出il-37的高、低表达患者的os和dfs生存时间,两组患者生存时间的差异通过log-rank检验分析,结果显示:il-37的高表达组hcc患者的os生存时间要显著长于低表达组(中位生存时间40.0vs27.0月,p=0.040),此外,il-37的高表达组hcc患者的dfs生存时间也要显著长于低表达组(中位生存时间27.0vs17.0月,p=0.006);将il-37基因片段行pcr扩增后连接至线性化表达载体,阳性转换子pcr产物大小为849bp,阴性转换子pcr产物大小为185bp,测序结果显示:阳性克隆与目的基因序列完全一致;将gv358-il1f7重组质粒转染293t细胞后,细胞内可观察到明显的绿色荧光,经westernblot检测可观察到30kda附近有特征条带,其分子量大小与目的基因相吻合;包装慢病毒48小时后提取并浓缩慢病毒,药筛法测得病毒滴度为9e+5tu/ml;构建稳定过表达il-37的smmc-7721、hepg2细胞系及其对照组细胞系,观察感染后72h细胞荧光分布,各组细胞的绿色荧光分布达90%以上,且无大面积细胞死亡发生,westernblot检测il-37表达水平,il-37的表达明显上调;划痕愈合实验结果显示:在过表达il-37的hepg2细胞的体外迁移力明显低于对照组,24小时的愈合率分别为10±2%和64±3%(p0.001),在smmc-7721细胞中,我们同样检测到过表达il-37组的迁移能力显著低于对照组,24小时的愈合率分别为17.33%±2和55±3%(p0.001);transwell实验结果显示:过表达il-37的hepg2细胞体外侵袭能力明显低于对照组,24小时穿过基质胶和微孔的细胞数量显著低于对照组(29±9vs.62±8,p=0.002),在过表达il-37的smcc-7721中,我们发现过表达il-37的smcc-7721细胞体外侵袭能力明显低于对照组,24小时穿过基质胶和微孔的细胞数量显著低于对照组(35±6vs.86±11,p=0.01);通过sirna沉默hcc细胞中的il-37的表达,在smmc-7721、hepg2细胞中转染si_il1f7及其对照si_nc,si_il1f7组的il-37的表达水平较si_nc组显著降低;用划痕愈合实验结果显示:在hepg2细胞中沉默il-37组的迁移能力显著高于对照组,24小时的愈合率分别为90±3%和60±7%(p0.001),在smmc-7721细胞中,沉默il-37组的迁移能力显著高于对照组,24小时的愈合率分别为83.33%±3.6和53±2%(p0.001);transwell实验结果显示沉默il-37的hepg2细胞体外侵袭能力明显高于对照组,24小时穿过基质胶和微孔的细胞数量显著低于对照组(102±12vs.39±9,p=0.002),在沉默il-37的smcc-7721中,沉默il-37的smcc-7721细胞体外侵袭能力明显低于对照组,24小时穿过基质胶和微孔的细胞数量显著低于对照组(94±18vs.49±4,p=0.002);用重组人IL-6处理SMMC-7721LV_NC和SMMC-7721LV_IL1F7细胞,SMMC-7721LV_IL1F7细胞可显著抑制IL-6对STAT3的激活作用;SMMC-7721LV_IL1F7细胞与SMMC-7721NC细胞相比,E-cadherin显著上调,MMP9、Vimentin表达显著下调,且IL-37可逆转IL-6引起的蛋白表达变化;裸鼠肺转移瘤实验结果示:SMMC-7721LV_IL1F7组较SMMC-7721LV_NC组肺转移灶数量显著减少,两组之间有显著性差异(3.400±1.435 vs.14.00±1.817,P0.001,n=5)。结论:通过本课题的研究证实IL-37具有抑制肝细胞癌侵袭转移的能力,其分子机制可能与抑制IL-6/STAT3信号通路诱导的EMT有关。IL-37在HCC进展中的分子机制可能有助于临床HCC或其他癌症治疗策略的制定,提供新的思路和治疗靶点。

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