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肿瘤相关巨噬细胞在索拉非尼抑制HCC中的作用及分子机制研究

【摘要】:第一部分肿瘤相关巨噬细胞的诱导与表型鉴定目的:体外诱导人PBMC细胞生成M1和M2型巨噬细胞,并分析其生物学表型特征。方法:本实验首先分离获得人外周血单核细胞(PBMC),再通过粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)或巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)分别刺激PBMC细胞分化成为M1型巨噬细胞或M2型巨噬细胞;Real-time PCR检测不同巨噬细胞表面分子CD68、HLA-DR、CD206及细胞因子TGF-β的mRNA表达水平;通过LPS分别刺激M1和M2型巨噬细胞,ELISA检测不同巨噬细胞分泌IL-10、IL-12及CD206的蛋白表达水平。结果:经GM-CSF诱导生成的M1型巨噬细胞CD68和HLA-DR表达量明显增加,ELISA结果显示其IL-12表达显著增高;而经M-CSF诱导生成的M2型巨噬细胞CD206表达量明显增加,ELISA结果表明其IL-10蛋白表达显著增高,IL-12蛋白表达显著降低。结论:体外成功诱导建立了M1型和M2型巨噬细胞,生物学表型符合各自特征。第二部分肿瘤相关巨噬细胞对HCC细胞生长及转移的作用及机制研究目的:探讨肿瘤相关巨噬细胞对HCC细胞生长及转移的作用,并分析其分子机制。方法:首先通过CCK-8法分析比较单独培养以及与M1/M2型巨噬细胞共培养后的Hep G2及Huh-7细胞的生长情况;采用Transwell实验检测单独培养以及与M1/M2型巨噬细胞共培养后的Hep G2及Huh-7细胞的迁移侵袭能力;western blot检测E-cardherin、Vimentin等EMT相关蛋白的表达;运用体外双荧光素酶报告基因检测mi R-101与其靶基因DUSP1的结合情况;经LPS刺激的M2型巨噬细胞分别给予不同条件处理,Real-time PCR检测mi R-101的m RNA表达,western blot检测DUSP1及其下游ERK、p38、JNK的蛋白表达情况。结果:相较于单独培养组及与M1型巨噬细胞共培养组,M2型巨噬细胞可以明显增加Hep G2及Huh-7细胞的增殖能力和迁移侵袭能力;western blot结果显示,与M2型巨噬细胞共培养后的HCC细胞E-cardherin表达降低,而N-cardherin、Vimentin蛋白表达明显增加;双荧光素酶报告系统证实mi R-101可以通过直接与DUSP1的3'-UTR区发生互补结合,从而抑制其m RNA和蛋白的表达;经AKT抑制剂处理后M2型巨噬细胞mi R-101表达下调,导致DUSP1的蛋白表达上调,从而影响其下游ERK、p38、JNK的蛋白表达。结论:M2型巨噬细胞可增加HCC细胞的生长及迁移侵袭能力,其机制可能与mi R-101调控DUSP1的表达,进而影响其下游ERK、p38、JNK信号通路有关。第三部分索拉非尼通过mi R-101调控肿瘤相关巨噬细胞释放TGF-β抑制HCC生长的机制研究目的:探讨肿瘤相关巨噬细胞在索拉非尼抑制HCC中的作用及其分子机制。方法:为了检测索拉非尼对M2型巨噬细胞中mi R-101表达的调控,我们将M2型巨噬细胞分别给予LPS和(或)索拉非尼处理,western blot检测DUSP1及其下游ERK、p38、JNK的蛋白表达情况,Real-time PCR检测TGF-β、CD206的m RNA表达水平,ELISA检测TGF-β、CD206的蛋白表达水平;通过CCK-8法分析比较单独培养以及与M1/M2型巨噬细胞共培养的Hep G2及Huh-7细胞经索拉非尼干预前后的生长情况,采用Transwell实验检测与M2型巨噬细胞共培养的Hep G2及Huh-7细胞经索拉非尼干预前后的迁移侵袭能力,western blot检测E-cardherin、Vimentin等EMT相关蛋白的表达;检测HCC细胞与经TGF-β阻断剂处理后的M2型巨噬细胞共培养的生长及转移情况;构建小鼠HCC模型并给予索拉非尼处理,免疫组化方法检测TGF-β及巨噬细胞表面分子CD68、HLA-DR、CD206的表达水平;Real-time PCR检测人HCC组织中TGF-β、CD206的m RNA表达水平,采用免疫组化检测人HCC组织中TGF-β及CD206表达水平,并分析其与临床病理资料的关系。结果:western blot结果显示,索拉非尼能明显增加DUSP1的表达,而降低ERK、p38、JNK的蛋白表达;Real-time PCR结果显示,给予索拉非尼干预的M2型巨噬细胞mi R-101、TGF-β、CD206的m RNA表达下调;ELISA结果显示TGF-β、CD206的蛋白表达下调;索拉非尼可以抑制与M2型巨噬细胞共培养的HCC细胞的生长及迁移侵袭能力;western blot实验显示,共培养后的HCC细胞E-cardherin表达降低,而N-cardherin、Vimentin蛋白表达明显增高;与经TGF-β阻断剂处理后的M2型巨噬细胞共培养的HCC细胞的生长及转移明显降低;通过体内实验发现,索拉非尼能够明显抑制肿瘤的生长,并且抑制HCC组织中TGF-β、CD206的表达;免疫组化结果显示,人HCC组织中TGF-β及CD206表达增加,并与HCC发生关系密切。结论:索拉非尼可以通过抑制M2型巨噬细胞中mi R-101的表达,使其失去对靶基因DUSP1的调控,进而抑制ERK、p38、JNK信号通路,影响M2型巨噬细胞释放TGF-β发挥抑制HCC细胞增殖及侵袭转移的作用。

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