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反义转化酶基因转入西瓜的研究

【摘要】: 本实验以亲本西瓜品种“火洲一号”为材料,研究西瓜高频再生体系的构建,农杆菌转化过程中各种参数的确定,再生植株的筛选鉴定等问题。并以西瓜子叶为外植体通过农杆菌介导的遗传转化方法将反义甜瓜转化酶基因转入西瓜基因组中获得转基因再生植株,主要结果分析如下: 高频再生体系构建的成功是遗传转化成功的最基本的要求。它涉及两个方面:第一,种子的无菌萌发。它直接关系到再生芽的分化率。从经济、省时、高质的角度考虑,以37℃恒温水浴箱浸种3~4小时,0.1%HgCl_2消毒5分钟,无菌水冲洗4~5次,插入方式置于0.8%琼脂培养基的方法最好。它可使污染率和畸芽率降至零,出苗率最高达97%,2天左右时间种子全部萌发。第二,再生芽获得的多寡与外植体种类、离柄距、苗龄、培养温度、光照时间、摆放方式、激素浓度等因素关系密切。外植体以离柄距0~1mm处,苗龄4~5天颜色由黄色完全变为绿色的子叶为最好;培养温度、光照长度分别以24~28℃、16h为宜;摆放方式呈自然状态,向阳面朝上时分化率显著提高;BA是西瓜子叶再分化必需的物质,AgNO_3有效提高芽分化率,两激素浓度的最佳配比为MS+2.0mg/lBA+4.5mg/lAgNO_3。在以上八种适宜条件下,再生芽的分化率可高达92%。分化芽多为双子叶丛生芽,畸形芽极为少见;1~2月后分化芽可长到2~3厘米,并长出不定根。 农杆菌介导的遗传转化方法研究深入,技术方法成熟,使用广泛,是双子叶植物较为理想的转化方法。质粒pGA643大小约为11.6Kb,它以花椰菜花叶病毒CaMV35S为启动子,抗性标记分别为卡那霉素和四环素。目的基因片段invertase大小为41Obp,以反向插入的方式置于T-DNA左右边界间。本实验采用冻融法将表达载体pGA643—INV转入农杆菌LBA4404中,使用抗生素Str、Rif、Kan对阳性菌落进行筛选。阳性菌落PCR检测表明农杆菌LBA4404中有INV基因,从而获得农杆菌工程菌株。工程菌液对外植体的侵染过程中涉及多个参数。实验表明:预培养时间2~3天,污染率低,转化率有所提高;菌液浓度OD_(600)≈0.4,浸泡时间9分钟,晾干时间20分钟转化效果较好;共培养时间一般要长于16小时,以5天为宜;在以上几种条件下,子叶经侵染后再生芽的转化率可达到0.97%。再生芽均为双子叶丛生芽,生长良好,2~3个月再生芽长高1~2cm,有少许不定根出现。 再生植株的筛选我们使用卡那霉素(Kan)。用未经农杆菌侵染的子叶为材料对选择压进行确定。卡那霉素浓度(mg/l)分别取25,50,75,100,125五个浓度梯度。当 — — 卡那霉素浓度为25,50lug/1时,多数子叶能产生愈伤组织,愈伤组织呈白色或白绿色, 富有光泽;分化芽数目以卡那霉素浓度25my 时较多,无褐化现象产生;卡那霉素浓 度升至 75mg八,愈伤组织形成时间推迟 3~4天,15~20天愈伤组织多褐化死亡无分化 芽产生;卡那霉素浓度进一步提高,愈伤组织不形成,外植体呈现黑绿色,皱缩,我们 确定卡那霉素浓度75mg/1为筛选用浓度;同时对抑菌用抗生素梭节青霉素浓度进行筛 选。浓度低于500mg/1时,农秆菌仍能小量生长,外植体边缘可见菌体,这将影响再生 1 植株鉴定的真实性;浓度高于5009/l时,外植体易产生过敏反应。从经济、高效的角 度考虑,梭芋青霉素浓度确定为500mg八。,” 通过组织培养、农杆菌侵染等步骤,获得得6棵再生植株。取植株叶片用CTAB法 皋二二品柴器二宁2滥江器岩之二二 功转入西瓜基因组中。

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