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高通量细胞电融合芯片及实验研究

【摘要】:细胞电融合技术是通过外界电场在离体条件下控制两个或多个细胞融合变成一个单核或多核杂合细胞的方法。相较于生物、化学和物理等诱导融合技术而言,细胞电融合技术具有效率较高、操作简便、对细胞无毒害、便于观察、适于仪器应用和规范操作等优点,逐渐成为了现代生物技术/生物工程研究领域的重要手段,已经在遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、免疫医学、医药制备以及食品工业等方面得到了广泛应用,特别是在杂交育种、药物筛选、单克隆抗体制备、抗癌疫苗研发、临床医学研究等方面成为了核心技术。 MEMS技术的产生使得细胞电融合技术向微尺度条件发展,该加工技术可以实现微米量级的微结构的加工,进而可以在芯片上集成大量微电极阵列,使得高通量细胞电融合成为可能;同时,微米量级的电极间距使得细胞电融合的电压可大大降低,进而可在低电压驱动条件下完成细胞电融合过程。 目前已经商业化的细胞电融合系统通常存在排队及融合效率低的问题。课题组前期通过研制细胞电融合芯片在上述领域取得了一定进展,细胞排队率达到了69.2±18.5%的水平,细胞融合率也较传统细胞电融合系统得到了显著改善(PEG融合法:1‰,传统电融合法:1%),排队后细胞融合率最高达到了50.2%的水平。但对于高通量细胞电融合芯片的工程化推广应用还有较大距离,特别是细胞的两两排队率和两两融合率两项指标还有待进一步提高;同时,课题组前期研究芯片在芯片的操作性,以及融合后细胞的鉴定方面还存在空白。因此,针对上述问题,本论文开展了相关的研究工作: 在深入研究细胞介电电泳、细胞电穿孔等经典理论的基础上,结合有限元分析方法,利用COMSOL仿真软件分析了微尺度条件下芯片内部的电场分布情况,探讨相关因素对电场分布的影响,并结合上述经典理论提出了芯片结构的优化设计方案,建立了微尺度条件下高效率细胞排队控制和电融合的方法,以提高芯片的两两排队率和融合率;针对细胞电融合芯片的进一步工程化应用,从提高芯片的可操作性和芯片排队及融合效率的角度出发,结合微加工技术,研究开展了系列化的高通量细胞电融合芯片:基于SOI基底的细胞电融合芯片→基于PI的柔性细胞电融合芯片→基于硅玻键合基片的细胞电融合芯片→基于表面电极技术的细胞电融合芯片;同时,本论文还根据实验需要,利用细胞电融合芯片及相关仪器设备构建了完善的细胞电融合实验平台;并利用该实验平台开展了覆盖动物、植物、微生物细胞在内的广泛的细胞电融合实验研究,利用荧光标记、融合后培养及核型分析等手段进一步验证了本系统电融合的安全性和有效性。具体而言,本论文的研究工作主要包括以下几个方面: 1.理论研究及芯片内部电场分布仿真计算 本论文结合电磁学、细胞电介质电泳、细胞电融合等经典理论,结合有限元分析方法,利用COMSOL仿真软件分析了微尺度条件下芯片内部的电场分布情况。重点探讨细胞电融合芯片各结构参数对芯片内部电场分布、电场梯度的影响;并根据相关仿真结果对芯片结构进行了优化设计,提出了一种高效率的电极结构模型。同时,本论文还根据经典理论和仿真结果,提出了微尺度条件有利于实现细胞排队控制与高效率电融合的方法,重点提高芯片的两两排队率和融合率。 2.系列化高通量细胞电融合芯片的研究 本论文结合理论分析及仿真结果,从芯片的可靠性、稳定性、集成度、生物相容性、细胞排队操控性、细胞电融合效率、实验过程可观测性以实验操作便利性多个角度出发,综合考虑了材料、加工工艺、封装实现、加工成本等多因素,以获得优化的芯片研制方案并陆续研制了系列化的高通量细胞电融合芯片。 3.细胞电融合实验平台的建立 本论文根据实验的具体需要,结合上述系列化的细胞电融合芯片的具体特征,利用相关仪器设备搭建了不同的细胞电融合实验平台,以获得高效的实验效果。 4.细胞电融合实验研究 本论文利用细胞电融合实验平台,开展了涵盖动物、植物、微生物细胞在内的多样化细胞的电融合实验研究。实验结果表明研究的系列化细胞电融合芯片能够在极低的驱动电压条件下工作(排队电压在2~10 V,融合电压在8~60 V),并较好的完成细胞电融合各过程,而芯片内部微电极的高集成度(103~105量级)为高通量的细胞电融合奠定了坚实基础。芯片在实验中表现出了良好的细胞排队控制能力,可以实现绝大多数的细胞完成排队迁徙(90±9.5%),同源细胞的两两排队率在40~60%的水平范围内,异源细胞的两两排队率也在35%水平以上。在良好的细胞排队控制基础上,细胞能够在芯片中以较高的效率完成电融合,排队后细胞的融合率平均水平最高达到了60%以上,最好水平达到了90%。远远超过了传统的PEG融合法(1‰)和电融合法(1%),也较课题组前期研究工作有了较大提高(细胞排队率:69.2±18.5%,排队后细胞融合率最高为50.2%)。 在微生物细胞的电融合实验研究,以基于SOI基片的细胞电融合芯片为载体,以BS-34菌株为研究对象,探讨了相关实验参数对细胞排队效率及电融合效率的影响,融合后的BS-34菌株的关键参数-乳化力得到了明显改善。 在烟草原生质体的实验中,以基于PI的柔性细胞电融合芯片为载体,本论文提出了利用细胞电融合方法构建烟草原生质体四倍体的实验方案,并开展了相关的实验研究。 在动物细胞电融合实验研究中,以基于硅玻键合基片的细胞电融合芯片为载体,探索了多种动物细胞的电融合实验参数并开展了相关融合实验,在此基础上利用NIH3T3细胞和小鼠胚胎干细胞(mMESc)进行体细胞与干细胞的电融合实验研究,实验结果表明本系统能够较好的实现体细胞与干细胞的电融合实验,并能够有效地控制细胞的排队运动,以较高的效率完成细胞电融合,融合后的细胞培养实验和核型分析结果也表明这一实验方案的可行性和有效性,可望探索出一条体细胞的再程序化研究新途径。 总之,本论文通过理论分析和仿真研究,分析了微尺度条件下细胞电融合芯片内部的电场分布情况,探讨了相关因素的具体影响;根据仿真结果研制了系列化的细胞电融合芯片;建立了相关的细胞电融合实验平台;开展了覆盖动物、植物、微生物的细胞电融合实验研究,取得了良好结果,为本系统进一步应用于微生物菌种改良、植物育种、体细胞再程序化研究等应用奠定了坚实基础。 同时,本论文还开展了后期改进方案的研究与设计,为进一步提高芯片效能,实现系统的微型化、集成化、系统化,建立一套完整的集成细胞进样预处理、细胞芯片上电融合、融合后细胞检测/分离纯化、融合后系统的芯片式培养奠定了良好基础。

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