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斜带石斑鱼piscidin-1天然肽的分离鉴定及免疫调节研究

【摘要】:Piscidin家族来源于鱼类的抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)体内是其非特异性免疫系统的重要组成部分,是一类含有20-50个氨基酸残基的小分子多肽,α螺旋结构,富含阳离子,具有疏水性和两亲性,具有广谱的杀菌、抗肿瘤、抗病毒的活性。有研究表明,斜带石斑鱼piscidin-1具有免疫增强的效果,但是其免疫调节的机制尚不明确,需要进一步深入研究,本实验室前期转录组学测序,piscidin刺激斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)脾脏淋巴细胞引起差异表达基因再经基于KEGG的信号通路富集分析,初步发现石斑鱼抗菌肽piscidin可调节石斑鱼自身免疫信号通路,但还未得到进一步的验证。本研究利用凝胶过滤层析和高效液相色谱-质谱联用技术首先从斜带石斑鱼的粘液组织里分离鉴定到piscidin-1预测成熟肽,证明了斜带石斑鱼piscidin-1表达后,经信号肽切除后成为ecPis-1L,还将进一步对其C端进行切割变为长度为21aa的成熟肽ecPis-1S。本研究进一步从斜带石斑鱼脾脏组织中分离纯化出淋巴细胞,利用ecPis-1S和ecPis-1L对离体培养的斜带石斑鱼脾脏淋巴细胞直接刺激处理,探究ecPis-1S和ecPis-1L对石斑鱼淋巴细胞增殖的影响。研究结果显示,ecPis-1S在浓度0.25μmol/L、0.5μmol/L、2.0μmol/L和4.0μmol/L对淋巴细胞进行刺激处理后能够显著刺激细胞增殖(p0.05),但未显示剂量依存关系;ecPis-1L在浓度0.25μmol/L、0.5μmol/L和4μmol/L对淋巴细胞进行刺激处理后能够明显的促进细胞增殖,但也不存在剂量依存关系,结果表明,石斑鱼抗菌肽ecPis-1S和ecPis-1L能够刺激斜带石斑鱼自身脾脏淋巴细胞增殖。本研究利用荧光定量PCR技术检测ecPis-1S和ecPis-1L对石斑鱼淋巴细胞免疫基因表达的影响,结果显示ecPis-1S和ecPis-1L在浓度4.0μmol/L下对淋巴细胞进行刺激处理24 h后与对照组相比转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGFβ)、Smad(Drosophila similar to mothers against decapentaplegic,Smad)家族蛋白基因、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,cdk)基因、白细胞介素1(interleukin,IL-1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)TNFα、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)编码基因、细胞分裂周期蛋白基因(cell division cycle protein,cdc)等相关免疫基因的表达显著升高(P0.05),表明ecPis-1S和ecPis-1L能够刺激斜带石斑鱼淋巴细胞相关免疫因子表达上调,进而激活有关通路,发挥免疫调节作用。

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