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基于CRISPR-Cas12a技术的病原菌检测方法的建立

【摘要】:病原菌可以快捷、准确和灵敏的检测是动物病害防控、食品安全等的前提条件。本研究利用CRISPR-Cas12a系统的基因编辑的切割功能和“附带切割(Collateral cle avage)”活性结合聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)建立了一套病原菌的检测体系。主要研究包括:1、CRISPR-Cas12a荧光检测系统的建立:采用亲和层析、分子筛、肝素柱纯化得LbCas12a蛋白。设计一条一端标记荧光团,一端标记淬灭团的ssDNA短链探针作为荧光报告物。通过优化Cas12a浓度、反应Buffer、pH、金属离子、靶标长度等因素确定Cas12a荧光反应体系。以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)nuc基因、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)ipaH基因、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)khe基因、单增李斯特氏菌(Listeri a monocytogenes)iap基因、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)tuf基因、伤寒沙门菌(Eberthella typhi)invA基因以及大肠埃希菌(Escherichia coli)chuA基因作为检测Target,根据每种基因的特异性保守位点设计PCR扩增引物。7种菌的最终PCR扩增条件通过优化引物浓度、退火温度和循环数来确定。根据7种菌的检测基因设计对应的crRNA序列,通过T7转录制备所需crRNA。针对灵敏度检测,我们将10倍梯度稀释后的7种不同病原菌DNA加入反应体系进行PCR扩增,反应产物作为目标物用于Cas12a荧光检测体系,灵敏度最高能达到10~1aM,最低能达到10~5aM。特异性研究显示,每种菌的引物和crRNA只能特异性介导目的菌的检测反应,产生明显的荧光信号,与其他非目标菌无交叉,表明该法方法具有很好的特异性。此外,针对金黄色葡萄球菌,Cas12a荧光检测体系的检测灵敏度为10~4aM,相比于荧光定量PC R(q PCR)检测方法提高了两个数量级。2、CRISPR-Cas12a试纸条检测系统的建立:设计一条一端标记羧基荧光素(FAM),一端标记生物素(Biotin)的ssDNA短链探针用于Cas12a试纸条检测体系。将7种菌进行PCR扩增,然后分别进行Cas12a检测反应,在15~20 min内即可直接用试纸条判读结果。结果显示,CRISPR-Cas12a试纸条检测系统能够特异性的检测7种不同病原菌。随后,选取革兰氏阴性菌痢疾志贺菌为模式菌对该方法的检测灵敏度进行研究。首先将痢疾志贺菌DNA和菌液样本分别进行10倍梯度稀释,随后DNA经PCR扩增后,进行Cas12a检测反应;而稀释后的菌液则用NaOH快速处理后直接PCR扩增,然后进行Cas12a检测反应。最终获得的切割产物分别利用试纸条判读结果。结果显示痢疾志贺菌DNA的检测限为10~2aM,痢疾志贺菌样本灵敏度可达10~4CFU/mL。本研究所建立的基于CRISPR-Cas12a检测体系可引入应用于水产动物病原菌的诊断,达到水产病原菌病害预警和防护的目的。

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