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斜带石斑鱼AMH/AMHRⅡ基因克隆鉴定、原核表达及多克隆抗体制备

【摘要】:斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)隶属于鲈形目、鲈亚目、鮨科、石斑鱼亚科、石斑鱼属,是一种生活在海水中具有较高营养价值和自然性逆转的雌雄同体鱼类,可以作为研究脊椎动物性别分化的模型。抗缪勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)及受体(anti-Mullerian hormone receptor II,AMHRII)为糖蛋白,属于TGF-β细胞因子家族。AMH基因在哺乳类研究中是因其具有引发缪勒氏管的退化和阻止雌性生殖器官的发育而得以命名。在硬骨鱼类中,虽然没有缪勒氏管存在,但在许多鱼类中AMH及其受体AMHRII基因都已被克隆鉴定,并且在性腺中检测到其表达,从而进一步证明了 AMH及其受体AMHRII基因在鱼类性别分化和性逆转方面起着某种作用。本文利用RACE方法克隆了 AMH及其受体AMHRII基因的全长cDNA序列并对其进行进化分析;利用RT-PCR方法对AMH及其受体AMHRII基因在不同组织器官中的表达量进行检测;并利用原位杂交的方法对AMH及其受体AMHRII基因在性腺中的表达进行定位;在对AMH及其受体AMHRII基因所扮演的作用进行分析及预测后,我们利用原核表达技术对AMH基因构建了原核表达系统并成功制备重组蛋白。为进一步研究和探讨AMH及其受体AMHRII基因在性别分化和性逆转方面的潜在作用打下了基础。结果如下:(1)斜带石斑鱼AMH基因的cDNA序列长为1726 bp,其中,开放读码框(ORF)1557 bp,编码518个氨基酸;AMHRII受体基因序列长为1822bp,开放阅读框(ORF)1497 bp,编码498个氨基酸。多重序列比对结果显示,斜带石斑鱼AMH基因序列与鲈鱼序列的同源性最高,达到83%;而斜带石斑鱼的AMHRII基因质序列也是与鲈鱼同源性最高,达到85%,证明斜带石斑鱼中AMH和AMHRII与鲈鱼具有相似功能。(2)RT-PCR结果表明,AMH在肠、肾、心、脑、垂体和皮肤中有少量表达;在肝、胃、鳃、肌肉和脾中几乎不表达,但是发现在斜带石斑鱼的精巢和卵巢中AMH均有着非常显著地表达,而且精巢中的表达量要远高于卵巢;AMHRII在肾、心、脑、垂体和皮肤中有少量表达;在肝、肠、胃、鳃、肌肉和脾中几乎不表达,但是发现在斜带石斑鱼的精巢和卵巢中AMHRII均有着非常显著地表达,而且精巢中的表达量要远高于卵巢。我们发现AMH及其受体AMHRII在不同组织器官内部的表达量有显著差异,主要集中在性腺中大量表达,这也说明了 AMH及其受体AMHRII在性别决定和性别分化方面扮演着非常重要的作用。(3)原位杂交结果表明AMH在精巢中主要是在精小囊周围的支持细胞中表达,在卵巢中主要集中在卵母细胞周围的颗粒细胞和滤泡细胞中表达;AMHRII中主要是在精小囊周围的支持细胞中表达,在卵巢中主要集中在成熟期卵母细胞周围的滤泡细胞中表达。由于AMH及其受体AMHRII不仅存在于精巢中,还在卵巢滤泡细胞中有表达,这个结果暗示AMH及其受体AMHRII还可能对卵巢发育产生了一定的影响。(4)利用原核表达技术构建了 AMH的重组蛋白,对AMH进行了表达条件的摸索、优化,应用Westernblot技术对表达蛋白进行验证并且纯化得到了特异性的蛋白,并采用免疫学方法制备重组AMH蛋白的多克隆抗体。综上,本论文以雌雄同体,雌性先熟石斑鱼为研究对象,初步探讨AMH/AMHRII系统在其性分化和性逆转中的潜在作用,为最终构建一个完整的鱼类内分泌调控系统以及进一步了解硬骨鱼性别分化,性逆转提供重要的理论基础。

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