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斜带石斑鱼(Epinephelus Coioide)类泛素化修饰相关基因的克隆表达及特征分析

【摘要】:石斑鱼在我国南方省区广泛养殖,经济价值极高。近年来,随着石斑鱼养殖规模的扩大,各种病害层出不穷,给养殖户带来巨大经济损失,也抑制了水产养殖业的发展。病毒病是危害石斑鱼健康养殖的常见病,主要病原包括石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)和神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)等。目前,石斑鱼与病毒相互作用的分子机制缺乏深入了解。小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin like proteins,Sumo)在哺乳动物体内与细胞免疫有关,而且参与一些病毒性疾病的免疫调节过程,但该蛋白在鱼体内是否也与病毒感染有关还不明朗,相关研究有待开展。Sumo化修饰作为重要的蛋白翻译后修饰方式,具有核质运输、细胞周期调控、信号转导、转录活性调控、参与DNA损伤修复等功能。该系统包含4个重要成员——sumo蛋白、激活酶E1、结合酶E2、连接酶E3。研究发现人体内含有四种sumo基因,即sumo1、sumo2、sumo3、sumo4,而本研究从斜带石斑中成功克隆到两个sumo基因,还有sumo唯一的结合酶E2-Ubc 9。本研究对斜带石斑鱼的sumo1、sumo2和结合酶Ubc9基因进行了序列分析。sumo1的cDNA全长为749bp,5'和3'非编码区分别为62bp和381bp,ORF区含306bp,编码101个氨基酸,蛋白预测大小为11.4KDa。Sumo2的cDNA全长为822bp,5'和3'非编码区分别为39bp和492bp,ORF区含291bp,编码97个氨基酸,蛋白预测大小为10.9KDa。Ubc9的ORF区含477bp,编码159个氨基酸,蛋白预测大小为18.13KDa。取健康鱼体的肝脏、脾脏、肾脏、脑、心脏、肠道、皮肤、肌肉、鳍条、胃、鳃丝、头肾共十二个组织进行组织分布分析,结果显示三种基因在不同组织均有表达,其中sumo1和sumo2在肠道和鳃的表达量较高,而且sumo2的表达量较高;ubc 9在肠道和鳃的表达量较高。SGIV和poly:IC刺激鱼体后sumo1和sumo2的表达量均为先升高后降低。成功构建原核表达载体pET-32a-sumo1和pET-32a-sumo2后,进行了融合蛋白的表达和纯化,随后用纯化的蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,western blot验证标明抗体具有特异性,多克隆抗体可作为标签用于筛选sumo靶蛋白。构建真核重组载体 pEGFP-N3-sumo1、pEGFP-N3-sumo2 和 pEGFP-N3-ubc9 后,转染石斑鱼脾脏细胞(GS cell)后观察其亚细胞定位,结果显示前两者均为全细胞分布,ubc9为细胞核分布,用制备的抗体进行免疫荧光进一步验证上述结果。构建pcDNA-3.1-flag-sumo1 和 pcDNA-3.1-flag-sumo2 重组质粒,转染 GS 和石斑鱼脑组织细胞(GB cell)筛选稳定转染细胞系,发现过表达sumo1和sumo2可以促进SGIV和NNV的复制,而sumo2的促进作用强于sumol。总之,本研究为sumo化修饰在石斑鱼免疫反应中所起的作用奠定了基础。

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