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H5亚型禽流感DNA疫苗及禽用免疫增强剂研制

【摘要】:禽流感(Avian Influenza,AI),是由A型流感病毒引起的一种感染多种鸟类和禽类的疾病综合症。近两年家禽感染H5亚型禽流感的疫情又开始增多,并给我国养禽业造成了巨大的经济损失。由于传统的灭活疫苗的缺陷限制了该病的净化,因此有必要开发新型的疫苗(例如DNA疫苗)作为技术储备。另外,鉴于DNA疫苗免疫家禽后免疫原性差或抗体水平低的现状,有必要开发新的免疫增强剂来改善DNA疫苗的免疫效果。本研究首先通过RT-PCR扩增2.3.4.4分支H5亚型禽流感病毒A/Goose/Guangdong/P45/2016(H5N6)的HA基因,再将其克隆至真核表达载体pCK,获得重组质粒pCKHA5。该重组质粒经测序正确后,将其转染到293T细胞中,经Western blot检测其是否表达。结果表明重组质粒pCKHA5能特异性地表达HA蛋白,表达的目的蛋白大小约64 kDa,成功获得了真核表达重组质粒pCKHA5。为研究鸭RIG I真核表达质粒是否可作为DNA疫苗免疫增强剂,以NCBI(National Center for Biotechnology)序列数据库公布的鸭RIG I和鸡MDA5基因序列作为原始序列,根据鸡密码子偏嗜性对鸭RIGI和鸡MDA5进行优化,分别获得了优化基因opCH-DKRIG I-HIS和opCK-MDA5-HIS;根据鸭密码子偏嗜性对鸭RIGI进行优化,获得了优化基因opDK-DKRIG I-HIS。再分别将其克隆至真核表达载体pCK,成功构建了pCKopCH-DKRIG I-HIS、pCKopCK-MDA5-HIS和pCKopDK-DKRIG I-HIS重组质粒。真核表达质粒pCKopCH-DKRIG I-HIS、pCKopDK-DKRIG I-HIS转染至293T细胞后,均能高效表达RIG I蛋白,它们大小分别约为106 kDa、106 kDa。为评估真核表达质粒pCKHA5作为DNA疫苗对鸡群的免疫效果和优化的真核表达质粒pCKopCH-DKRIG I-HIS是否对鸡具有免疫增强作用,使用DNA疫苗和免疫增强剂单独或联合免疫鸡。试验将44只3周龄SPF鸡随机分为4组,每组11只。其中对照组11只鸡腿肌内外侧多点注射200μL PBS,其它免疫组分别注射200μL pCKHA5质粒、pCKopCH-DKRIG I-HIS质粒、pCKHA5质粒和pCKopCH-DKRIG I质粒。首免2周后进行二免。结果显示:H5亚型禽流感病毒HA基因真核表达质粒pCKHA5免疫SPF鸡,一免1周后血清抗体HI平均值约为0.08log2,一免2周后血清抗体HI约为1log2;二免1周后血清抗体HI上升到2.83log2,二免2周后血清抗体HI约为3log2。重组质粒pCKHA5和pCKopCH-DKRIG I-HIS联合免疫鸡,一免1周后血清抗体HI平均值约0.08log2,一免2周后血清抗体HI约为1.25log2;二免1周后血清抗体HI上升到3.25log2,二免2周后血清抗体HI平均值约为3.58log2。因此,pCKHA5和pCKopCH-DKRIG I-HIS联合免疫组比pCKHA5组抗体水平略高。二免2周后以100μL 2.3.4.4分支H5亚型禽流感病毒A/Goose/Guangdong/P45/2016(H5N6)分别攻击上述各组被免疫鸡只。PBS对照组和pCKopCH-DKRIG I-HIS组攻毒2天内全部死亡,且全部排毒。pCKHA5组、pCKHA5和pCKopCH-DKRIG I-HIS联合免疫组攻毒两周内,所有鸡只均存活,但部分鸡只排毒,其排毒率分别为27.27%、18.18%,其保护率分别为72.73%、81.82%。因此,本研究中构建的H5亚型禽流感病毒HA基因真核表达质粒pCKHA5可以诱导被免疫鸡群产生足够的抗体以免于2.3.4.4分支H5亚型禽流感病毒的攻击而致死,但部分鸡只会排毒。

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