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锌依赖的DNA结合蛋白家族基因OsPLATZ的功能研究

【摘要】:株高和穗型是重要的农艺性状,与作物的产量密切相关,揭示其调控机制和网络具有重要意义。本文研究一个水稻Plant A/T-rich sequence-and Zinc-binding protein编码基因OsPLATZ,其功能敲除突变体表现株高变矮、穗型增大、粒型变小、种子萌发率下降等多种表型,说明OsPLATZ在水稻株高及穗部性状的发育过程中起重要作用。PLATZ蛋白超家族是一类新型的植物特异的依赖于锌的DNA结合蛋白,能够非特异性结合富含A/T的序列,起转录抑制作用。该家族的首个成员是2001年在豌豆中发现的。目前水稻中6个PLATZ同源基因的功能均未见报道,其它植物中该家族成员的基因功能也鲜见报道。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑方法和超表达技术研究OsPLATZ基因的生物学功能,利用Quantitative RT-PCR(qRT-PCR)和原位杂交的方法分析该基因的表达模式,利用原生质体瞬时表达系统分析OsPLATZ蛋白在细胞内的定位情况,同时还利用酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)筛库的方法寻找该基因的候选互作因子。取得如下主要研究结果:(1)利用CRISPR/Cas9基因编辑方法对OsPLATZ基因进行功能敲除,对获得的T_0和T_1代转基因植株、以及osplatz敲除突变体与野生型杂交的F_3代进行基因型鉴定、表型观察和共分离分析,发现突变体从种子萌发至成熟整个生长发育过程不同阶段都出现异常表型,如:种子萌发率降低、株高变矮、叶变短、谷粒变小、杂合体二级枝梗数及穗粒数增加等,说明OsPLATZ具有多效性。(2)qRT-PCR实验表明OsPLATZ在幼穗形成期表达水平较高且特异,原位杂交实验结果表明该基因在一级枝梗和二级枝梗分化时期均有表达,该结果与敲除突变体的穗部表型一致,进一步证明OsPLATZ参与调控水稻的穗部性状发育。(3)对F_3代植株基因型与表型共分离情况进行分析,结果表明在矮化表型方面敲除突变体osplatz呈半显性。(4)成功构建Ubi启动子驱动的OsPLATZ超表达载体和融合3×FLAG标签的超表达载体,两者均获得多个独立转化事件的转基因植株,为后续研究OsPLATZ的生物学功能和分子调控机制创制了实验材料。(5)亚细胞定位分析结果表明OsPLATZ定位于细胞核,提示其可能是一个转录调控因子。(6)以OsPLATZ为诱饵,通过Y2H筛选水稻幼穗cDNA文库,获得9个OsPLATZ候选互作因子,进一步验证表明该蛋白与Os09g0416500基因的编码产物之间存在互作关系。综上所述,本论文初步揭示了OsPLATZ的生物学功能和表达模式,筛选获得了该基因的1个互作因子,为更近一步探索OsPLATZ参与水稻生长发育调控的分子机制奠定了基础,同时也为进一步了解和揭示PLATZ蛋白超家族可能的功能提供了新资源。

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