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穴蚁蛉幼虫全长均一化cDNA文库的构建及ESTs初步分析

【摘要】:药用昆虫穴蚁蛉Myrmeleon sagax (Walker)的幼虫俗称蚁狮,属脉翅目蚁蛉科昆虫。自古以来,蚁狮就被我国传统医学用于治疗多种疑难杂症,其干粉可用于治疗泌尿道结石、脉管炎、高血压、中耳炎和血栓等多种慢性疾病,其体内含有多种未知的抗菌及其它药用功能的蛋白。 本研究首先利用大肠杆菌诱导蚁狮产生免疫反应,收集诱导后3hr、6hr和12hr时段的蚁狮全虫,分离纯化mRNA,结合SMART (Switching Mechanism At 5’end of RNA Transcript)全长cDNA文库与DSN (duplex-specific nuclease)均一化技术,以质粒pDNR-LIB为载体,构建穴蚁蛉幼虫全长均一化cDNA文库,并通过平板计数法和菌落PCR方法评估文库的质量。所得的原始文库滴度达到7.5×105cfu/ml,而扩增文库则为1.95×1011cfu/ml,平均插入片段长度为1200 bps。 从文库随机挑选192个单克隆进行5′端EST测序,共得到190条有效序列,平均读长为1340bps。文库重组率达到98.96%,序列信息在GenBank登录号为HO059798-HO059987。利用EST piper等系列软件平台对EST序列进行处理和拼装后,共得到179条独立基因(Unigenes),其有效序列长度主要集中在650bp-850bp之间,平均长度为683bp,文库的非冗余率为97.26%。 经Blast2go和DNA star软件进行功能注释和分类,结果发现,这些基因中含有:1)与昆虫免疫相关基因,包括防御素1前体、防御素C以及攻击素E等;2)与心血管相关的基因,如血管紧张素受体相关蛋白和激肽释放酶等;3)多种与消化相关的酶类,如糜蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、胰弹性蛋白酶、蛋白水解酶和胰蛋白酶等;此外,还有多种与能量代谢等相关的蛋白质等。蚁狮全长均一化文库的构建可为日后筛选药用功能蛋白以及从基因水平上研究这类昆虫生长发育提供平台。

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