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促卵泡素调控斜带石斑鱼性别分化的分子机制研究

【摘要】:鱼类作为脊椎动物中最大的一个类群,具有极其复杂的性别决定方式,主要分为基因型性别决定(genotypic sex determination,GSD)、环境型性别决定(environmental sex determination,ESD)两种类型。而且,在性别决定完成之后,鱼类的性别分化过程也受到诸多因素的影响。目前认为,在鱼类的性别分化过程中,性激素起到了决定性的作用,尤其是雌激素。而内源性雌激素合成受到其合成限速酶芳香化酶(cyp19a1a)的控制。此外,鱼类中促性腺激素(gonadtropin,GtH)能通过调控cyp19a1a等性激素合成限速酶编码基因的表达来改变性腺中性激素的水平。而且,很多研究表明GtH之一促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)可能参与到鱼类的性别分化过程。斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)是一种雌雄同体雌性先熟的鱼类,其性腺全部先分化为卵巢,因此其可作为研究鱼类性别分化的理想材料。我们的之前的研究发现,斜带石斑鱼促性腺激素及其受体fshr在性腺分化过程中高表达,表明它们可能调控斜带石斑鱼的性别分化,但该信号调控石斑鱼性分化的功能和分子机制还不清楚。基于此,本研究以斜带石斑鱼为研究对象,探讨FSH在其先雌性分化过程中的作用及其分子机制,主要研究结果如下:1.通过对分化期的斜带石斑鱼进行FSH长期注射,发现FSH注射首先加速了卵巢分化的进程,但是随后却诱导了雄性命运。检测FSH处理过程性腺中的基因表达量发现,雌性相关基因的表达量起初上调但随后出现显著性下降,而雄性相关基因则只呈现上调的表达模式。性类固醇合成通路相关酶编码基因的表达量在处理过程呈现显著性上升的表达模式。与之相符,血清中雌雄激素水平也出现显著性上升。对分化期的斜带石斑鱼进行短时间FSH注射发现,低剂量FSH注射激活雌性相关基因(特别是cyp19a1a)的表达,但高剂量下却抑制雌性相关基因的表达,激活雄性相关基因的表达。离体实验(HEK293T细胞)发现,低剂量的FSH能激活cyp19a1a的表达,但高剂量的FSH却没这个效果。综上所述,FSH的功能与其浓度相关,即低浓度诱导卵巢分化而高浓度则诱导雄性命运。2.对未分化(孵化后50天)的斜带石斑鱼进行甲基睾酮(17α-methyltestosterone,MT)投喂或者甲基睾酮和雌二醇(17β-estradiol,E2)同时投喂(MT+E2),结果发现MT投喂导致性腺不育,而同时投喂E2可以拯救这种表型。在斜带石斑鱼的性别分化期间(孵化后90天)进行MT或者MT+E2投喂都会诱导雄性命运。检测性别相关基因表达模式发现,MT和MT+E2投喂抑制雌性相关基因的表达,而上调雄性相关基因的表达。与基因表达模式相符,血清11-KT水平也在MT和MT+E2投喂组中上调。随后我们还追踪了MT和MT+E2诱导性逆转过程中的雄性标记DMRT1以及细胞增殖抗原的表达细胞,结果发现雄性生殖细胞以及精巢体细胞可能分别来自于原有性腺中的性原细胞以及体细胞。综上所述,我们发现在斜带石斑鱼中,雌激素扮演了天然诱导卵巢分化的角色,而雄激素能够在外源雌激素补偿的情况下诱导雄性命运。3.使用不同剂量的芳香化酶抑制剂(aromatase inhibitor,AI)投喂分化期的斜带石斑鱼,结果低剂量的AI使性腺停滞在未分化的状态,而高浓度的AI则诱导了雌性到雄性的性逆转。有趣的是,对未分化的斜带石斑鱼进行AI和AI+E2投喂,结果都诱导了由雌到雄的性逆转。而诱导雄性命运之后停止AI和AI+E2投喂,性腺则会退回到原始性腺状态并重新开始卵巢分化。检测投喂过程中性别分化相关基因的表达模式发现,AI和AI+E2投喂抑制雌性相关基因的表达,而上调雄性相关基因的表达;停止投喂后,AI和AI+E2投喂对雌性相关基因的抑制作用和对雄性相关基因激活作用都消失,其表达量都回复到与对照组接近的水平。与基因表达模式相符,血清11-KT水平也在AI和AI+E2投喂组中上调;停止AI和AI+E2投喂后,血清E2水平下降程度显著变小,而11-KT水平则出现显著下降。最后我们还检测了处理过程中细胞凋亡和增殖信号,结果发现,在天然的卵巢分化过程中,激素生成细胞增殖,使雌激素合成上调,促进卵巢分化;而AI和AI+E2投喂诱导了细胞凋亡形成输出小管,随后周围出现雄性生殖细胞,但并没有雄性激素生成细胞的增殖出现;停止AI和AI+E2投喂后,激素生成细胞增殖,重新分化出卵巢腔。综上所述,在斜带石斑鱼性别分化过程中,cyp19a1a的表达上升诱导了天然卵巢分化,而只要抑制了cyp19a1a的表达就会诱导精巢分化。4.使用MT、E2和MT+E2对分化期的斜带石斑鱼进行腹腔注射,3-24 h后检测fshβ的表达。结果发现这三种处理均能够上调垂体中fshβ的表达。随后我们克隆得到fshβ启动子,并预测了该启动子上雌激素和雄激素的响应元件(ERE和ARE),发现其具有两个ERE和4个ARE。离体细胞实验发现,E2能通过era激活fshβ启动子活性,而11-KT则通过ara和arb激活fshβ启动子活性。

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