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amh基因在斜带石斑鱼性别分化中的作用机制研究

【摘要】:脊椎动物的性腺发育和性别分化涉及多种机制。硬骨鱼类由于种类繁多,导致了鱼类的性腺发育和性别分化机制多样。尤其在性逆转鱼类中,性腺发育和性别分化的研究仍然有限(目前的研究仅限于雌、雄激素和芳香化酶等研究)。众所周知,内源性雌激素是硬骨鱼类卵巢分化的诱导因子。然而,鱼类中性别分化除了受性激素影响外,还可以受到遗传因素抗缪勒氏管激素(amh)的影响。目前,AMH在雌性哺乳动物中可以通过减少芳香化酶(CYP19A1)的生物合成起作用,而且AMH对原始卵泡的募集和卵泡的发生有重要的作用。相比哺乳动物而言,硬骨鱼类中对于amh的研究较少。斜带石斑鱼是一种雌雄同体且雌性先熟的鱼类,在发育过程中经历性逆转,因此是研究脊椎动物的性别决定和性别分化的理想模型。针对性逆转斜带石斑鱼中性别决定和性腺分化研究的空白,本文成功的构建了amh在体过表达模型,并探索了amh在性别决定和性别分化过程中所起的功能,同时也初步研究了amh对于相对应的信号通路的调节。取得的研究结果如下:(1)原核表达纯化后,我们制备了amh的多克隆抗体,对得到的抗体进行Western blot和免疫组化检测,验证抗体的特异性。在性腺不同的分化时期和各组织内利用Western blot检测发现,从卵巢向精巢过渡的过程中,amh信号逐渐呈现一个增强的趋势,并且发现仅在性腺(精巢高表达,卵巢低表达)中检测到amh信号,而在其他组织中未检测到。免疫组化也证明了制备的多克隆抗体具有特异性。(2)通过成功建立的在体过表达模型,在亚成年斜带石斑鱼中进行投喂amh质粒实验。实验结果表明,与对照组性腺相比,投喂组鱼性腺发生了结构的变化,即卵巢出现退化并伴随着精原细胞和精母细胞的出现。荧光定量也表明体内雄性相关基因的表达量显著升高,而雌性相关基因的表达量显著下降。同时激素测定发现,与对照组相比,amh质粒投喂组中,血清中的E_2含量有了显著性下降,而血清中的11-KT含量却出现显著性升高。结果表明amh在斜带石斑鱼性逆转过程中发挥的重要作用,即可以提前使卵巢退化并使性别决定为精巢。(3)通过成功建立的在体过表达模型,在未分化的幼年斜带石斑鱼中进行投喂amh质粒实验。实验结果发现,与对照组性腺相比,投喂组鱼性腺发生了结构的变化,即卵巢出现退化和凋亡并伴随着精原细胞的大量出现。荧光定量也表明出体内雄性相关基因的表达量显著升高,而雌性相关基因的表达量显著下降。同时激素测定发现,与对照组相比,amh质粒投喂组中,血清中的E_2含量有了显著性下降,而血清中的11-KT含量却出现显著性升高。结果表明amh在斜带石斑鱼的性别分化中发挥着重要作用,即amh可以调节性腺出现雄性分化趋势而不用先经历雌性分化。(4)最后,基于上述在体实验结果推测amh上下游可能存在的信号通路,进行离体实验。实验结果表明,利用细胞系表达纯化得到的Amh蛋白具有生物活性,并且证明斜带石斑鱼中的Amh可以激活下游的Smad磷酸化通路。细胞系中双分子荧光互补实验证明,目标蛋白Smad5和下游Smad4可以进行互作。共转染amh表达质粒后会对cyp19a1a的启动子活性产生明显的抑制作用。同时发现,在cyp19a1a启动子上Smad特异性的结合区域主要是-2257/-2246bp和-1834/-1823bp位置。综上所述,离体实验可以初步证明在斜带石斑鱼中存在amh-Smads-cyp19a1a信号通路。

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