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马尾松木质素合成途径中4CL基因克隆及RNA干扰载体构建研究

【摘要】:马尾松分布范围广泛,木材纤维较长,因而成为主要造纸树种之一。造纸工业最大的技术难题是木质素的降解,这个过程不仅要消耗大量的化学药品,更为严重的是产生大量造纸废液,对环境造成极大的破坏。因此,培育低木质素含量的造纸原料树种,已成为破解造纸污染难题的林业生物技术前沿研究的趋势,将产生巨大的经济效益和生态效益。本文以我国造纸优势资源树种马尾松为研究对象,克隆马尾松木质素合成调控的关键基因:4-香豆酸辅酶A连接酶(4-Coumarate:Coenzyme A Ligase,4CL),构建马尾松4CL基因的RNA干扰载体,并通过农杆菌介导的叶盘法转入模式植物烟草,为低木质素马尾松转基因育种提供了科学依据和技术基础。 获得了以下主要结果: (1)马尾松4CL基因的全长克隆。以马尾松叶片和次生木质部为材料,分别提取基因组DNA和总RNA,并分别以总DNA和以总RNA反转录的cDNA作为模板,根据4CL基因的保守区域分别设计多对引物,通过同源PCR克隆及RT-PCR技术扩增出4CL基因的DNA片段和cDNA片段,并将产物克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5a菌株。经双向DNA测序及Blast分析,证实已获得2696bp的4CL全长基因组DNA克隆和1642bp的全长cDNA克隆,并将结果提交至Genebank中。 (2)马尾松4CL基因的生物信息学分析。通过生物信息学软件Vector NTI10.0和NCBI在线软件对马尾松4CL基因进行分析。结果表明,马尾松4CL全长基因组DNA为2696bp,含有5个外显子和4个内含子;全长cDNA为1642bp,含有一个1440bp的可读编码框。应用蛋白质分析软件对4CL推导的蛋白质序列的理化性质、二级结构等进行分析。结果显示4CL蛋白由480个氨基酸残基组成,分子量为51.975KDa,等电点为5.84,存在2个跨膜区域,为疏水性蛋白,定位于线粒体膜上,有信号肽,属于分泌型蛋白。 (3)马尾松4CL基因的原核表达研究。以马尾松4CL全长cDNA为模板,设计特异表达引物,通过双内切酶BamHI-XhoI方法,插入至表达载体pET-32a中,构建融合表达质粒pET32a-4CL,并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达。IPTG诱导表达结果表明,马尾松4CL蛋白在诱导4h时,表达量最大。 (4)马尾松4CL基因的RNA干扰载体构建。以克隆的马尾松4CL全长cDNA为模板,设计特异引物,通过高保真扩增技术获得了马尾松4CL的正义、反义基因干扰片段,大小分别为390bp和390bp;以pRi35S作为桥梁载体,成功构建马尾松4CL基因的RNA干扰载体:pRi35S-4CLzfo (5)马尾松RNA干扰载体pRi35S-4CLzf的遗传转化研究。通过农杆菌介导的叶盘法转化技术,将载体pRi35S-4CLzf导入模式植物烟草并获得T0代转基因植株。对经过抗性筛选和PCR验证后的转基因植株的生长表型观察表明,与野生型植株相比,转基因烟草植株没有出现矮化、倒伏等不良现象。利用Klason方法对随机选取的转基因植株和野生型烟草植株的主茎进行木质素含量测定,结果表明,与野生型烟草植株相比,转4CL基因的烟草植株的木质素含量均有所降低,绝对含量平均降低了3.81%,相对含量降低了15.41%。

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