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量子点活体追踪AD转基因鼠Aβ变化及GLP-1干预的保护作用

【摘要】: 研究背景: 阿尔茨海默病(AD)是一种原因不明,以进行性认知功能障碍、行为和人格障碍等为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病。Aβ是构成神经炎性斑的核心和血管沉积物的主要成分,被认为是AD最重要的致病物质之一。AD的病因和发病机制至今尚不清楚,越来越多的证据提示炎症反应在AD的病因和病理过程中具有重要作用,同时也是AD动物模型致病的一个主要原因。胰高血糖素样肽1(GLP-1)是由肠道内分泌L细胞分泌的肠促胰岛素,具有亲神经性,对神经元轴突的生长,神经元的营养有一定的调节作用,能防护谷氨酸诱导的凋亡和氧化应激损伤,可能成为具有潜在价值的治疗AD的新方法。量子点(QDs)是一种新型的荧光分子探针,具有荧光强度高、激发光谱连续而宽、光学稳定性好等优势。应用量子点探针活体成像观察Aβ的动态变化及药物对AD的疗效,对阿尔茨海默病的早期诊断与早期治疗具有十分重要的意义。 研究目的: 本研究通过水迷宫和分子生物学方法探讨GLP-1及衍生物对AD可能保护作用及机制,利用量子点-抗体探针活体追踪GLP-1干预前后AD转基因模型Aβ的变化,探讨GLP-1治疗AD的疗效及其神经保护作用机制。研究方法:1.将正常C57BL小鼠随机分3组:QDs组、QDs-Ap-Ab组、对照组,各组小鼠分别行量子点、量子点-Ap-Ab探针、PBS侧脑室注射后,采用组织形态学和动物行为学观察,应用石墨炉原子吸收光谱法检测血、尿中镉含量,全自动生化检测仪测定肝肾功能,系统考察量子点和制备的探针的生物毒性作用。 2.将饲养10月和16月的APP转基因鼠、正常C57BL小鼠随机分为:T10组、GLP-1A组、GLP-1±ExA组、正常组和T16组、GLP-1B组、GLP-1+ExB组、正常组,侧脑室连续注药后行水迷宫实验,并取材进行形态学观察,利用ELISA方法检测TNF-α和IL-1p蛋白含量,采用免疫组织化学和量子点荧光组织化学方法检测GFAP、Aβ、GLP-1R蛋白的表达,Real-time PCR检测GLP-1R mRNA基因的表达,Western blot检测p-p38MAPK蛋白含量的变化。 3.利用动物活体整体荧光成像系统和体视显微镜监测T10组、T16组、GLP-1A组和正常组量子点探针标记Aβ的变化,检测3天后断头取脑组织冰冻切片,荧光显微镜观察,验证Aβ的变化。 研究结果: 1、琼脂糖凝胶电泳检测到目的条带,证明量子点-Ap-Ab探针制备成功。毒性检测HE染色示QDs-Ap-Ab组海马CA1区细胞形态、结构与对照组相似;尼氏染色示探针组海马CA1区神经元形态正常,尼氏体清晰可见,与对照组无差异;石墨炉原子吸收光谱法检测示侧脑室QDs与QDs-Ap-Ab探针注射后12h,尿镉含量较对照组明显增加,1-7dQDs组、探针组的尿镉含量与对照组相比,差异无统计学意义;行为学观察7d,三组小鼠进食进水正常,二便正常,无举尾、皮肤毛发颜色改变,无步态异常、兴奋抑制反应,均无死亡;QDs组和QDs-Ap-Ab组血清ALT、AST、BUN和CRE水平与对照组无明显差异(P0.05)。 2、T10组、T16组空间学习记忆能力、思考应变能力明显下降;海马神经元受损明显,线粒体结构不清;IL-1p、TNFα含量明显增多,GFAP、Aβ、GLP-1R蛋白表达明显增高,Aβ、GLP-1R蛋白表达区域部分重叠;GLP-1RmRNA水平增高明显;p-p38蛋白含量增多。侧脑室连续5d注射GLP-1后,GLPA组小鼠空间学习记忆能力、思考应变能力明显改善,GLPB组小鼠空间学习记忆能力、思考应变能力改善不明显;GLPA组L-1p、TNFα含量较T10组明显下降,GFAP、Aβ、GLP-1R蛋白表达明显减少,GLP-1RmRNA水平明显降低;p-p38蛋白含量减低。用GLP-1和Exendin Fragment9-39同时干预T10组,其空间学习记忆能力、IL-1p、TNFα含量、GFAP、Aβ、GLP-1R蛋白表达量、GLP-1RmRNA水平、p-p38蛋白含量与T10组无明显差异。 3、NH2-QDs-605脑内非特异性积聚较QDs-605明显NH2-QDs-605在脑脊液中光学特性稳定,生物相容性好。量子点-Ap-Ab探针标记16月和10月转基因鼠Ap,发现前者荧光范围较后者扩大,连续观测3天,量子点荧光强度没有衰减;GLP-1干预10月APP转基因鼠5天后,其荧光范围减小,荧光亮度降低;脑组织冰冻切片观测验证了上述结果。 研究结论: 1.成功构建了量子点-Ap-Ab探针,在一定的条件下,量子点及量子点-Ap-Ab探针对小鼠整体毒性作用小,生物相容性好。 2.GLP-1R在APP转基因模型海马组织、大脑皮层中表达增高,证实GLP-1可能通过与GLP-1R结合,参与减缓炎症反应、改善APP转基因鼠的学习和记忆能力。 3.GLP-1抑制脑组织中p38MAPK活化是减轻APP转基因鼠脑内的炎症反应的可能机制之一。 4.量子点-Ap-Ab探针可应用于活体动物脑内研究,并能有效识别APP转基因鼠脑内的Ap沉积。 5.量子点-Ap-Ab探针荧光成像可以应用于AD转基因模型抗p淀粉样蛋白斑块干预的疗效检测。

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