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比色法羟自由基测定条件的优化与应用

【摘要】: 目的:确定分光光度法体外羟自由基测定的优化条件与实际应用的意义,为羟自由基的体外检测与抗氧化剂的筛选提供检测方法。 方法:采用经典的硫酸亚铁(FeSO_4)与过氧化氢(H_2O_2)Fenton反应,以二甲亚酚(DMSO)为羟自由基捕捉剂,对原有的实验方法作了改进;通过试验确定该检测体系的主要影响因素以及适宜的范围;采用正交设计,分析了三种不同水平的FeSO_4、H_2O_2和DMSO对检测体系的影响,确定其合理的搭配;对硫脲、还原型谷胱甘肽(GSH)、草莓提取液以及金属硫蛋白(MT)抗氧化能力的检测,验证了检测体系应用的可行性与实际意义。 结果:以固蓝B盐代替固蓝BB盐提高了显色反应的稳定性,避免了吡啶的使用。该检测体系合适的盐酸浓度范围为7.5~10mmol/L,合适的反应时间为10~40min,FeSO_4、H_2O_2和DMSO的合适浓度分别为3.0~4.0mmol/L;16~32mmol/L和40~60mmol/L。正交实验结果分析FeSO_4,过氧化氢和DMSO的极差分别为0.066、0.026和0.020,FeSO_4对反应体的影响最大,其次为H_2O_2,DMSO影响最小。检测体系最优的合理搭配是:FeSO_4 3.6mmol/L;H_2O_2 24mmol/L,DMSO60mmol/L。检测结果3小时内稳定,重复测定变异系数小于6%。GSH与硫脲均具有清除羟基自由基的能力,在40mmol/L的浓度上,清除率分别为43.2%与77.5%,硫脲清除羟自由基的能力较GSH为大。草莓提取液也具有清除羟自由基的作用,当草莓提取液加入量为2ml时(相当于10g草莓),清除率能达33.8%。加入MT含量不同的肝组织匀浆液,其清除羟自由基的能力有明显差异,锌诱导组(76.5μg/ml)与对照组(28.5μg/ml)的清除率分别为24.27%与7.85%。 结论:该检测体系合适的实验条件是10mmol/L HCl;3.6mmol/L FeSO_4;24mmol/L H_2O_2和60mmol/LDMSO,反应时间为10min;该检测体系可用于体外羟自由基清除剂的筛选和某些生物材料抗氧化能力的评价。

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