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补肾活血法对AD模型小鼠行为学的影响及其作用机制研究

【摘要】:目的研究中医补肾活血法指导下中药复方(益智健脑方浓缩液)以及针刺(“补肾活血针刺法”)对阿尔茨海默病模型小鼠SAMP8 (Senescence Accelerated Mouse P8, SAMP8)的行为学影响,从不同侧面阐明补肾活血法对SAMP8小鼠的治疗作用以及防治AD的可行性;分析并鉴定补肾活血法(中药复方以及针刺)干预后SAMP8小鼠海马组织的差异蛋白质表达,在蛋白质的层面上探讨补肾活血法治疗阿尔茨海默病的潜在作用靶点蛋白,从复杂疾病多靶点治疗策略的角度分析补肾活血法防治AD的作用机制。 方法将5月龄雄性SAMP8 30只随机分为中药治疗组(n=10)、针刺治疗组(n=10)和模型对照组(n=10),中药治疗组以益智健脑方浓缩液灌胃;针刺治疗组予以“补肾活血针刺法”干预,同时予以等剂量双蒸水灌胃;模型对照组以等剂量双蒸水灌胃;另设5月龄雄性SAMR1小鼠(n=10)作为正常对照组,也予以以等剂量双蒸水灌胃。为了减少组间偏倚,尽量使各组小鼠的抓取时间、抓取程度以及灌胃轻重程度保持一致,均由同一个操作熟练的技术人员来完成。4周后,采用Morris水迷宫对各组小鼠的行为学进行检测分析其学习记忆能力的变化;行为学实验后,应用双向凝胶电泳(2-DE)技术分别分离中药治疗组、针刺治疗组和模型对照组SAMP8小鼠海马组织总蛋白,胶体考马斯亮蓝染色,Image Scanner图像扫描仪及Image Master双向凝胶电泳软件对图像进行扫描分析,以模型对照组为参照对象,将中药治疗组以及针刺治疗组中有意义的差异蛋白质点经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析得到肽质量指纹图谱(PMF),经MSDB和NCBInr数据库查询,鉴定差异蛋白质点;采用Western blot和免疫组化的试验方法对部分差异蛋白质点进行验证,同时检测这些差异蛋白在正常对照组SAMR1小鼠海马组织中的表达水平。 结果 1. Morris水迷宫实验中,模型对照组SAMP8小鼠的逃避潜伏期较正常对照组SAMR1小鼠的逃避潜伏期时间明显延长(P0.05),停留在原平台象限的时间和穿越原平台次数较正常对照组SAMR1小鼠明显减少(P0.05);补肾活血法指导下,采用中药复方益智健脑方浓缩液以及“补肾活血针刺法”干预均能够明显缩短SAMP8小鼠的逃避潜伏期(P0.05),增加其停留在原平台象限的时间和穿越原平台次数(P0.05)。 2.以模型对照组的2-DE图谱为参照对象,分别与中药治疗组以及针刺治疗组SAMP8小鼠海马组织的2-DE图谱进行比较,结果发现中药治疗组与模型对照组存在19个差异点,其中11个在中药治疗组表达上调,8个表达下调;针刺治疗组与模型对照组存在13个差异点,其中7个在针刺治疗组表达上调,6个表达下调; 3.中药治疗组选取的14个差异表达点中最终得到鉴定的有11个点,其中6个表达上调,5个下调;针刺治疗组选取的10个差异表达点中得到鉴定的有9个点,其中6个表达上调,3个下调。根据蛋白质数据库中提供的信息,分析这些潜在治疗靶点蛋白在AD治疗中的作用,发现这些差异蛋白在AD中治疗作用机制涉及Aβ代谢的调节、tau蛋白磷酸化的调节、抗氧化应激、抑制神经炎症、调节线粒体能量代谢以及糖代谢功能等方面。 4.差异蛋白验证结果: (1) Western blotting结果:选取了同时在中药治疗组和针刺治疗组均有差异性表达的蛋白flotillin-1和GFAP,检测flotillin-1和GFAP在模型对照组、正常对照组、中药治疗组以及针刺治疗组的表达水平,结果发现模型对照组SAMP8小鼠海马组织flotillin-1和GFAP的表达水平较正常对照组SAMR1小鼠明显增强(p<0.05);而补肾活血法干预能够明显降低中药治疗组以及针刺治疗组SAMP8小鼠海马flotillin-1和GFAP的表达水平(p<0.05),这同蛋白质组学的结果相一致。 (2)免疫组化结果:采用了免疫组化的方法检测了flotillin-1和GFAP、仅在中药治疗组有差异性表达的Pinl和仅在针刺治疗组有差异性表达的NGb,结果显示模型对照组SAMP8小鼠海马组织flotillin-1和GFAP的表达水平较正常对照组SAMR1小鼠明显增强(p<0.001);补肾活血法干预能够明显降低中药治疗组以及针刺治疗组SAMP8小鼠海flotillin-1和GFAP的表达水平(p0.001),同蛋白质组学以及Western blotting研究结果相一致;模型对照组SAMP8小鼠海马组织Pin1以及Ngb的表达水平较正常对照组SAMR1小鼠明显减弱(p0.001);补肾活血中药复方益智健脑方浓缩液能够明显增强SAMP8小鼠海马组织Pinl的表达水平(p0.001),“补肾活血针刺法”能够明显增强SAMP8小鼠海马组织Ngb的表达水平(p0.001),与蛋白质组学结果相一致。 结论 1.中医补肾活血法(中药复方益智健脑方浓缩液、“补肾活血针刺法”)能够明显改善AD模型小鼠SAMP8的学习记忆能力以及记忆巩固、再现能力。 2.补肾活血法是通过多靶点、多途径、多机制的作用方式对AD模型小鼠SAMP8发挥治疗作用的,相关的治疗作用机制涉及Ap代谢的调节、tau蛋白磷酸化的调节、抗氧化应激、抑制神经炎症、调节线粒体能量代谢以及糖代谢功能等多方面,这一方面与AD病因机制的复杂性相契合,另外还与复杂性疾病的多靶点治疗策略相契合,可以为AD的治疗提供有益的借鉴。 3.发现了补肾活血法防治AD的一些潜在治疗靶点蛋白,为进一步确定这些靶点蛋白及其在防治AD中的相互联系奠定基础。

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