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基于DNA链杂交反应的生物传感器的研究及应用

【摘要】:DNA链杂交反应具有经济、实时和高灵敏度的特点,被广泛应用于医学诊断、基因检测和环境监测等领域。链置换反应和杂交链式反应是DNA链杂交的两种形式,常被用于检测细胞、DNA、蛋白质和金属离子等。链置换反应指通过DNA链杂交使旧链剥离的过程,它已被用于多种体外等温扩增策略,譬如滚环扩增、环介导的等温扩增等。杂交链式反应是一种现代的信号放大机制,它利用目标物触发打开多个发卡探针,使信号放大,反应条件温和。本文以DNA链杂交反应为基础,开发了三个不同的生物传感器,用以测定HCV DNA、HPV DNA和H7N9 DNA,具体情况如下:(1)基于链置换反应和杂交链式反应无酶无标记荧光法检测HCV DNA。在HCV DNA存在时,HCV DNA与HP1杂交,诱发HP1和HP2发生链置换反应,形成HP1-HP2复合物。加入HP3和HP4后,HP1-HP2复合物可以引发HP3和HP4发生杂交链式反应,形成DNA长双链结构。加入的SG I可与DNA长双链结合,发出强烈的荧光信号。实验结果表明,体系荧光强度差值与H7N9 DNA浓度在0.1-10 nM范围内有着线性关系,检出限为82 pM。(2)目标物触发的多循环荧光及比色法检测HPV DNA。HPV DNA打开发夹HP1和HP2发生链置换反应,产生长双链DNA,加入Nt.BbvCI之后发生剪切作用,产生很多富含G碱基的DNA链。加入ThT之后,能形成G-四链体使荧光增强。由荧光法可以检测HPV DNA;当加入氯化血红素(Hemin)之后,与Hemin结合形成的G-四链体可以催化氧化ABTS~(2-)显色,因此可以通过多种方法高效、灵敏地检测HPV DNA。荧光法检测的线性范围为0.05-5 nM,检出限为32.9 pM;紫外法检测的线性范围为0.4-15 nM,检出限为0.284 nM;而HPV DNA浓度在0.4-15 nM范围内,实验体系的颜色变化逐渐加深,可用目视比色法直接观察实验结果。(3)基于核酸外切酶III辅助的目标物循环无标记荧光法检测H7N9 DNA。体系加入H7N9 DNA后,与发夹HP1作用,利用Exo III的剪切特性,目标物被释放,进行循环,并且产生大量的富含G碱基的DNA,当与荧光染料硫磺素T(ThT)结合时,形成G-四链体,体系荧光增强。实验结果表明,体系荧光强度差值与H7N9 DNA浓度在0.05-25 nM范围内有着线性关系,检出限为17 pM。

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