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微囊藻毒素-LR对草鱼和斑马鱼免疫基因表达及草鱼免疫器官超微结构的影响

【摘要】: 微囊藻毒素可影响鱼类的胚胎发育、行为和生长,也可引起肝脏、肾脏等内部器官的病理变化和鱼体生理生化指标的变化。然而,有关微囊藻毒素对鱼类免疫系统毒性的研究则几乎是空白。本研究以草鱼和斑马鱼为对象,采用电镜、荧光定量PCR和基因芯片技术在细胞和分子水平上揭示了MC-LR对鱼类免疫系统的影响。 通过腹腔注射微囊藻毒素-LR(MC-LR;纯度>98%,50μg/kg体重),发现MC-LR不仅引起草鱼肝脏病变,而且还引起免疫器官的病变。MC-LR对肝细胞的早期毒性表现为细胞间连接间隙增宽,肝细胞中出现胆汁淤积,其线粒体和内质网也受到损伤,但到注射MC-LR 21天后草鱼肝细胞超微结构基本正常。在脾脏和头肾中受损的细胞主要是淋巴细胞。MC-LR可引起草鱼脾脏淋巴细胞的凋亡,在注射MC-LR 2天后,观察到大量细胞出现凋亡;7天后,凋亡细胞减少,到21天大部分细胞与对照组没有差异;MC-LR可引起草鱼头肾淋巴细胞线粒体、内质网损伤,到21天则观察不到这样的病理变化。 用荧光定量PCR检测了草鱼在注射MC-LR(纯度>98%,50μg/kg体重)1、2、4、7、14和21天后,白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、Ⅰ型干扰素(IFNⅠ)、免疫球蛋白M(IgM)、主要组织相容性复合体Ⅰ(MHC-Ⅰ)、长链肽聚糖识别蛋白(PGRP-L)等六个免疫基因在脾脏、头肾和肝脏中的表达。发现IL-1β在头肾中的表达受到抑制,在所有的取样时间内与对照组均有显著差异(P<0.05)。肝脏、脾脏和头肾中TNF-α、IFNⅠ和PGRP-L的表达同样受到了显著抑制(P<0.05);肝脏中IgM和MHC-Ⅰ的表达则受到显著抑制(P<0.05)。这说明MC-LR可抑制草鱼的免疫功能。 经腹腔注射MC-LR(纯度>95%,400μg/kg体重)12、48、96小时后,取斑马鱼肝脏,利用三个时间段的混合样品和对照组分别与Affymetrix公司斑马鱼基因芯片进行杂交,筛选差异表达的基因。该基因芯片包括14900个转录本,处理组斑马鱼的基因表达与对照组的比值大于等于2或小于等于0.5时,认为该基因表达上调或下调。经两次芯片重复实验发现有273个基因(10.13%)出现了表达水平的变化,表达上调的基因数为243个,下调的仅为30个。根据基因的功能注释进行分类,上调的基因主要包括细胞骨架结构类、细胞外基质成分、凋亡基因、肿瘤因子、应激因子、信号转导因子、细胞循环因子、生长因子、运输因子、转录因子、代谢相关基因和免疫因子;下调的基因主要包括免疫相关的基因。进行基因本体论(Gene Ontology)分析发现MC-LR主要引起细胞循环(Cell cycle)和丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK signal pathway)的变化,通路分析结果表明MC-LR可能引起了斑马鱼肿瘤的发生,而大量免疫基因表达的下调则表明MC-LR可能抑制了斑马鱼的免疫功能,这也与在草鱼中观察到的结果一致。

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