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水花生干旱、盐胁迫应答基因的克隆及表达分析

【摘要】: 在野外我们观察到水花生生境很广,从水生到中生到旱生,与之相应的是适应水生生活的须根也演变成适应旱生生活的又粗又长的肉质根,以利于保水和从土壤深处吸收水分。另外,水花生也能够在400mM的NaCl环境中生长,其抗盐能力超过大部分农作物。将水花生与水稻一起种植,进行干旱和盐处理,发现水花生具有比水稻更强的抗旱、耐盐性能。为比较水稻和水花生抗旱抗盐差异的生化机制,测量了抗渗透物质和抗氧化酶。结果发现,在干旱、盐处理后,水花生体内脯氨酸(Proline)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)都仅比水稻高一点,而总抗氧化活性(T-AOC)却比水稻高出很多,这说明上述物质单独的作用很小,这一方面解释了过去转单独的一个上述基因效果不好的原因,另一方面提示我们今后在转基因育种时,尽量转信号传导上游的基因。 为克隆干旱、盐胁迫发生时水花生根部表达上调的基因,我们采用了mRNA差异显示技术。 为保证用于差异显示的试验材料具有相同的基因型,我们将单一水花生母株截成许多部分栽培在细沙基质上,浇灌Hoagland营养液于人工气候室内培养。为分离抗旱抗基因,剪取干旱、盐胁迫前后水花生的须根,经提取RNA、DNA酶消化、电泳检测质量合格后用于逆转录得到cDNA,用3个锚定引物和26个随机引物共78个引物组合作PCR扩增,共得到126条干旱诱导上调的基因片段、118条盐胁迫诱导上调的基因片段。在上述的基因片段中,有3个干旱诱导的、1个盐胁迫诱导的基因能被反向Northern证实表达上调,随后对其进行克隆和测序。基因片段大小分别为612bp、294 bp、93bp、609 bp。随后对他们进行Blast比对,结果表明,干旱诱导上调的大小为612bp的基因片断与cryptogein(隐地蛋白)编码基因有36%同源性,片段大小为294bp、93bp的基因与其他基因序列同源性很低,可能是新的基因序列,而片段大小为609 bp的基因片断与拟南芥编码ATP binding / kinase/ protein kinase/ protein serine/threonine kinase/ protein-tyrosine kinase的基因有同源性。随后采用末端快速扩增技术(RACE)扩增上述3个基因的全长,结果只有一个基因全长得到扩增。该基因被命名为ApCL ,全长738 bp,开放阅读框501 bp,推导出的蛋白质有166个氨基酸组成,分子量16.7道尔顿。半定量PCR进一步证明该基因除了受干旱诱导上调外,也受盐胁迫诱导上调。将该基因转入酵母,结果酵母的抗旱抗盐性有所提高,所有这一切,都表明ApCL是一个抗旱、抗盐基因,其参与抗旱抗盐的机制被讨论。

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