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辣椒素改善高糖诱导的AD样病变及其机制研究

【摘要】:第一部分 辣椒素保护高糖诱导的AD样tau蛋白过度磷酸化通过抑制GSK-3β 背景:阿尔茨海默病(alzheimer disease, AD)是一种临床表现以患者进行性认知功能障碍和记忆力损害为主的最常见的老年痴呆。其典型病理变化是细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)和细胞外形成老年斑(senile plaques, SP)。NFTs主要由细胞内tau蛋白过度磷酸化所致,而SP则主要由于细胞外β-淀粉样多肽(β-amyloid, Aβ)沉积而成。微管相关蛋白tau病变是AD的早期病变,其磷酸化水平与AD病人的痴呆程度成正相关。糖原合成激酶(glycogen synthase kinase-3p, GSK-3β)激活和蛋白磷酸酯酶-2A (protein phosptase-2A, PP2A)的失活在AD患者Tau蛋白过度磷酸化中起关键作用,但引起他们活性异常和平衡紊乱的上游原因和机制,目前仍然不清楚。 2型糖尿病(T2D)和AD有很多相似的危险因素、临床特征和行为学改变。糖代谢紊乱会加剧3xtg-AD模型鼠tau蛋白磷酸化和空间学习记忆障碍。T2D是AD的独立危险因素,代谢紊乱可能是AD的早期变化之一,但二者之间相互联系的本质和机制还不清楚。 Capsaicin是TRPV1受体(transient receptor potential vanilloid subfamily member1, TRPV1)天然激活剂,TRPV1通道被激活后促进Ca2+为主的阳离子内流。喂食capsaicin激活TRPV1后可促进线粒体的生物合成、提高运动耐力、并防止高脂饮食所诱导的代谢紊乱,对应激诱导的AD样病理改变有保护作用,能够改善糖尿病小鼠的代谢失调和稳定体内糖平衡。但是capsaicin激活TRPV1后通过什么途径或方式保护神经元、改善AD样病变机制不清楚 目的:研究辣椒素对tau蛋白磷酸化的作用及机制 材料与方法:采用给高蔗糖长期饮食方法制造糖代谢紊乱模型,分组如下:①常规饲料+常规自来水饲养组;②常规饲料+20%蔗糖水饲养组;③0.01%的capsaicin饲料+20%蔗糖水饲养组和④0.01%的capsaicin饲料+常规自来水饲养组。饲养过程中尾静脉取血动态观察血糖和体重变化,24周造模成功后,采用水迷宫以及条件恐惧实验检测小鼠的学习记忆能力的改变;采用离体脑片电生理技术检测长时程增强(long-term potentiation, LTP)的改变:采用实时荧光定量PCR和免疫印迹方法检测TRPV1的mRNA和蛋白含量;采用免疫印迹和免疫组化染色方法检测GSK-3β、tau蛋白磷酸化位点、AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)和线粒体相关蛋白等的变化;采用尼氏染色方法检测神经元数目的改变;采用试剂盒检测GSK-3p活性、丙酮酸盐的含量、线粒体膜电位(MMP)、线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ (Complex Ⅰ)活性和ATP的生成量。 结果:我们发现长期高糖饮食造成(1)tau蛋白的多个AD相关磷酸化位点(Ser262、214、199, Thr205和Ser202+Thr205)的磷酸化水平升高;(2)海马的神经元丢失,树突棘减少,突触可塑性减弱、LTP受抑制;(3) GSK-3β活性升高,同时Ser9磷酸化水平降低:(4)空间学习记忆障碍和酮酸堆积、线粒体代谢障碍,出现MMP和Complex Ⅰ活性下降伴随ATP生成减少。而同时长期给予capsaicin饮食激活TRPV1通道,可能通过细胞内外维持钙离子平衡,从而减轻高糖饮食引起上述AD样变化。 结论:长期高糖饮食可通过降低GSK-3p-Ser9位点的磷酸化上调GSK-30活性进而引起tau蛋白多个AD相关位点的磷酸化;可致线粒体功能受损伤。而线粒体功能受损是更早期事件,可以通过长期少量给予capsaicin激活TRPV1/AMPK/PGC-1α通路,恢复线粒体功能从而早期预防或缓解AD的病理变化和症状。本研究不仅为从日常饮食出发预防AD提供理论指导,而且为新的靶向药品研发提供新的参考指标。 第二部分 辣椒素改善AD样病变通过TRPV1/AMPK/PGC-1α通路 背景:我们已经在第一部分证明高糖可以造成C57BL/6J出现代谢相关AD样病理变化及功能损伤,这主要是由于高糖激活GSK-3p而不是由于PP2A失活。我们还发现AMPK和PGC-la这些调控线粒体的分子活性或蛋白表达量降低、线粒体功能受损。而同时给予辣椒素可以缓解小鼠的tau蛋白病变并抑制GSK-3β活性,增加AMPK和PGC-1α的表达、缓解线粒体受损。那么是AMPK调控GSK-3β?还是TRPV1直接调控GSK-3β呢?这些活动是发生在线粒体损伤之前还是之后呢?其内在机制是什么到目前为止尚无报道。 目的:阐明辣椒素通过激活TRPV1/AMPK/PGC-1a通路保护线粒体改善AD样病变及其内在机制。 材料和方法:采用N2a/APP细胞为模型细胞,给予不同浓度(11.25mMr的NG,20mM,30mM和40mM)处理选出能够使tau蛋白磷酸化水平显著升高的30mM作为高葡萄糖培养基。同时给予或不给辣椒素处理后检测各组tau蛋白磷酸化水平,GSK-3β、PP2A活性和AMPK和PGC-1α等线粒体相关蛋白或活性变化。并用不同的处理方式同时或不同给予GSK-3β抑制剂SB216763、AMPK激动剂AICAR和抑制剂compoundC以及TRPV1抑制剂capsazepine,探讨AMPK调控GSK-3β的机制,TRPV1在这一过程中起什么作用。采用质粒转染和免疫荧光、免疫印迹及免疫酶联反应技术检测实验结果。 结果:30mmM的高糖培养基可诱导N2a/APP细胞的tau蛋白多个磷酸化位点Ser262、 Ser214、Ser199、Thr205和AT8(pSer202+pThr205)的磷酸化水平在培养48小时后显著升高、GSK-3p活性升高、cleaved caspase3表达升高、但线粒体相关蛋白及AMPK表达水平下降,同时给予辣椒素可以逆转上述变化。给予GSK-3β的抑制剂SB216763,能够抑制高糖培养的N2a/APP细胞tau蛋白磷酸化增加;AICAR对tau蛋白的磷酸化影响和SB216763相似,CompondC作用则相反;给予Capsaicin不能直接调控GSK-3β,但是在同时给予AICAR激活AMPK后GSK-3β活性下降,CompoundC抑制AMPK活性后Capsaicin对GSK-3β舌性抑制作用则解除。 结论:(1)在体外,30mM高糖培养基长期培养可以使tau蛋白多个AD相关位点磷酸化水平升高;(2)高糖介导tau蛋白磷酸主要是由于GSK-3β激活造成的;(3)辣椒素激活TRPV1是AMPK发挥调控GSK-3β作用的必要条件。(4)辣椒素可能通过激活TRPV1/AMPK/PGC-1α通路保护线粒体改善AD样病变。

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