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食管癌相关纤维细胞对食管癌放化疗敏感性的影响及其分子机制研究

【摘要】:目的:食管癌(Esophagus Carcinoma, EC)是我国发病率居第八位,死亡率居第四位的常见恶性肿瘤,且以食管鳞癌为主,约占90%。食管癌早期症状不明显,临床确诊时约70%-80%的患者已丧失手术机会,化疗及放疗成为局部晚期食管癌的主要治疗手段。目前,食管癌患者的五年生存率尚不足15%,究其主要原因为食管癌对其常用的化疗药物如顺铂、紫杉醇等均表现出极其有限的敏感性,且食管癌易对放疗产生显著的抵抗性,导致患者治疗结束后易出现肿瘤复发或转移。迄今为止,国内外针对食管癌耐治疗抵抗的分子机制研究均着眼于癌细胞本身,而未关注肿瘤微环境的影响。事实上,肿瘤微环境的主要成员肿瘤相关纤维细胞与肿瘤的发生发展有密切的关系,因而亟待阐明食管癌相关纤维细胞对食管癌放化疗敏感性的影响及其分子机制。方法:1.通过原代培养的方法从食管鳞癌患者手术切除的癌组织中及配对的正常食管上皮组织中分离培养食管癌相关纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)及配对的正常纤维细胞(normal fibroblasts, NFs),并且通过免疫组化染色实验、免疫印迹分析实验(Western Blotting, WB)对CAFs及其NFs进行鉴定。2.通过MTT实验、qRT-PCR实验、WB实验、免疫组化染色实验、免疫荧光实验、流式细胞仪Annexin V/PI双染色法、Elisa实验、固相抗体芯片筛选、克隆形成实验、建立裸鼠移植瘤模型、TUNEL等实验在体内外水平系统地研究CAFs、NFs对食管癌细胞放化疗敏感性的影响及其分子机制。结果:1.鉴定发现CAFs及NFs中上皮细胞标志物E-cadherin染色呈阴性,纤维细胞标志物Vimentin染色呈阳性。而癌纤维细胞相关标志物如a-SMA,FSP-1及FAP在CAFs中的表达量显著高于在配对的NFs中的表达量,表明已成功地分离培养了CAFs及配对的NFs。2.检测发现CAFs较NFs相比可介导食管鳞癌细胞KYSE-150、KYSE-180对顺铂、紫杉醇、5-Fu、CPT-11、长春新碱、表阿霉素、多烯紫杉醇、卡铂产生显著的抵抗性。进一步的分子机制研究显示CAFs较NFs及食管癌细胞相比可分泌大量的TGFβ1 (Transforming Growth Factorβ1)。且CAFs分泌的TGFβ1通过激活食管癌细胞内的NF-κB抗凋亡信号通路,诱导食管癌细胞发生上皮间质转化等途径介导食管癌细胞的化疗抵抗性。此外,CAFs与食管癌细胞的相互作用可促进TGFβ1自分泌/旁分泌信号通路激活,从而进一步促进了食管癌的化疗抵抗性。生存分析显示食管癌相关纤维细胞中TGFβ1的表达量与食管癌患者术后经过化疗治疗的总生存率显著相关。3. CAFs较NFs及食管鳞癌细胞KYSE-150、KYSE-30相比可分泌大量的CXCL-1 (The chemokine (C-X-C motif) ligand-1)。进一步的研究显示CAFs分泌的CXCL-1通过调控食管癌细胞的DNA损伤修复响应介导食管癌细胞产生了显著的放疗抵抗性。结论:1.食管癌相关纤维细胞通过分泌TGFβ1介导食管癌细胞产生显著的化疗抵抗性。2.食管癌相关纤维细胞分泌的TGFβ1可激活食管癌细胞内的NF-κB抗凋亡信号通路,诱导食管癌细胞发生上皮间质转化。2.食管癌相关纤维细胞中TGFβ1的表达量可作为食管癌患者术后接受化疗治疗的独立预后因子。3.食管癌相关纤维细胞通过分泌CXCL-1调控食管癌细胞的DNA损伤修复响应从而介导食管癌细胞产生显著的放疗抵抗性。上述研究成果率先从肿瘤微环境的角度阐明了食管癌产生放化疗抵抗性的分子机制,弥补了肿瘤微环境在食管癌放化疗抵抗性研究领域中的诸多空白,并为临床研究如何提高食管癌患者的放化疗效果提供新的参考依据和理论指导。

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