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基于限制性核酸内切酶放大技术的miRNA检测生物传感器

【摘要】:微小RNA(miRNA)的异常表达量与癌症和疾病的发展相关,所以miRNA已经成为一种能够对癌症诊断和治疗组织性的生物标志物。因此,快速高效检测miRNA新方法的研究变得刻不容缓。最近,在限制性核酸内切酶和聚合酶的基础上,自动的聚合-剪切等温扩增酶放大过程已广泛地用于miRNA检测。EXPAR是一种有前途的高灵敏度,低成本和可用于临床样品miRNA实时检测的非线性放大方法。由于高扩增效率,EXPAR能在短时间内迅速放大寡核苷酸链数。我们基于EXPAR放大技术和酶的使用,设计了两个体系来检测miRNA。一个是基于三通路结构(3-WJ)驱动的trigger辅助的指数酶放大(T-EXPEA)超灵敏检测miRNA;一个是二次使用分子信标的指数酶放大反应用于超灵敏检测miRNA。我们设计了一种新型的用三通路(3-WJ)结构驱动的trigger辅助的指数酶放大(T-EXPEA)超灵敏检测miRNA方法,该实验方案在癌症诊断和治疗领域有很大应用潜力。在本试验中,目标物miRNA可以打开发夹探针,并引发反应,因此特异性地形成稳定的3-WJ结构。然后,它可以在聚合酶和限制性核酸内切酶的配合下产生下放大。所产生的triggers可用于打开分子信标(MB)和引发T-EXPEA反应。在T-EXPEA部分,产生的指数triggers来启动新的T-EXPEA,获得很大增幅的荧光信号和放大效率。我们方法的特点在于将T-EXPEA和3-WJ结构结合用于荧光miRNA检测。值得注意的是,在T-EXPEA部分与3-WJ部分trigger的序列设计是相同的。另外,在发夹探针和MB中设计的限制性核酸内切酶酶切位点是相同的内切酶Nt.BbvCI,该设计提高了反应效率,减少了成本。这种方法可以定量检测特异性序列miRNA,从10 aM到10 pM的动态范围,最低检出限是7.8 aM。第二个实验方案中,我们设计了一个可以二次利用分子信标MB、使之二次打开从而产生一个叠加的呈指数放大趋势的荧光信号用于超灵敏快速检测miRNA。在该设计中,目标物miRNA首先引发产生一个3-WJ结构,在聚合酶和内切酶的共同作用下,初次打开一个发夹状分子信标,产生初级的荧光信号。并且产生的primer探针可以与一个发夹探针结合,并且在聚合酶和内切酶的共同作用下产生trigger链,此trigger链又可以再次引发分子信标MB,在聚合酶和内切酶的共同作用下使之打开,产生二级荧光信号,产生指数型放大。该方法的检测范围较广,为10 aM-1 pM,检出限为3.5 aM。

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