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外切酶循环放大技术检测肿瘤标记物及其在分子逻辑门体系中的应用研究

【摘要】:本文基于核酸外切酶循环放大技术,实现了对血小板衍生因子(PDGF)和DNA等肿瘤标志物高灵敏、高选择性检测检测,并建立分子逻辑门体系。 主要开展了以下两方面的工作: 一、核酸外切酶级联循环放大技术检测血小板衍生因子 本文建立了一种核酸外切酶级联循环放大技术,基于血小板衍生因子(PDGF-BB)与其适体的特异性识别作用,实现了对PDGF-BB的化学发光免标记高灵敏检测。该体系由双链DNA(核酸适体-受体)、两种发卡结构DNA分子,以及核酸外切酶组成。通过核酸适体与PDGF-BB的特异性识别并结合,运用ExoIII对双链结构的特异性剪切,实现核酸外切酶级联循环放大。反应后释放出大量的DNA酶,其与hemin结合形成辣根过氧化物DNA模拟酶(DNAzyme),采用luminol-H2O2化学发光反应体系检测,对PDGF-BB的检测限可达6.8×10-13M。本方法设计简单,实验条件温和且为均相反应,免标记成本低,效率高。对于具有适体序列的生物分子具有广泛适用性。 二、核酸外切酶循环放大技术检测DNA及其在分子逻辑门体系中的应用研究 基于核酸外切酶循环放大技术实现了对DNA的高灵敏检测,并用于分子逻辑门体系。将DNAzyme序列设计到不同的DNA链中,通过与其互补链杂交,使DNAzyme序列处于封闭状态,从而不能与hemin结合。当实验体系中加入引发链,会形成能够被核酸外切酶剪切的特定结构,进而释放DNAzyme序列。通过测定体系化学发光强度的变化,实现DNA高灵敏检测,并成功构建分子逻辑门体系。

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