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长链非编码RNA在类风湿关节炎中的差异表达和相关性研究

【摘要】:长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)作为一类长度大于200bp的非编码RNA,因其灵活的调节方式以及在基因表达的不同层面发挥功能,在近年生物学及临床医学领域受到越来越多的关注。长链非编码RNA广泛存在于哺乳动物细胞,与mRNA类似通常由RNA聚合酶Ⅱ转录形成。lncRNA,在基因表达调控的各个层面通过RNA-RNA、RNA-DNA、RNA-蛋白质相互作用的不同的作用方式发挥功能。lncRNA参与染色质修饰、转录调节、转录产物的剪切加工、翻译后的修饰等转录过程的不同环节,影响细胞及组织器官的生长、发育、分化及凋亡过程,在维持机体正常的生理功能中发挥了重要的作用,如Xist,是沉默X染色体的关键因素;H19参与基因印记;lincRNA-RoR,参与胚胎干细胞的分化等。在免疫系统中,lncRNA参与了免疫细胞分化及活化过程,在免疫细胞的功能发挥及启动炎症反应等方面发挥重要作用,lncRNA也参与了免疫相关基因的表达调控。lnc-DC在DC细胞中高表达,敲除该基因后,严重影响了包括CD40,CD80,CD86,和CCR7在内的涉及抗原提呈、T细胞活化和细胞迁移等过程的DC特异性基因产物的表达,使得DC细胞不能有效的作用于CD4+T细胞或者在接受抗原刺激后不能分泌细胞因子。CD4+T细胞的分化为Th细胞亚群对于启动抗原特异性的适应性免疫应答意义重大,许多研究显示lncRNA是CD4+T细胞分化过程中的重要参与因子。T细胞亚群表达谱的分析研究显示lincR-Ccr2-5' AS在Th2细胞中特异性表达,沉默lincR-Ccr2-5' AS表达后,Th2细胞中约1200个基因表达受影响。lncRNA RMRP,一个位于Th17细胞细胞核内的lncRNA,可以与Th17的核转录因子RORγ t和DDX5在位于编码TH17细胞重要效应分子位点形成的复合物,促进Il17a和I117f等细胞因子的生成。敲除RMRP后TH17分泌细胞因子水平下降,RMRP基因突变会导致一种先天性免疫功能紊乱所致的疾病:软骨毛发发育不全症。Treg细胞在免疫耐受和控制自身免疫疾病中具有重要作用。转录因子FOXP3是TREG细胞分化和发挥功能的重要转录因子,CNS3是FOXP3的增强子元件。特异性表达于Treg 细胞中的 lncRNA FLICR(FOXP3 long intergenic non-coding RNA)位于FOXP3基因附近,可以通过顺式作用增强FOXP3的表达,从而促进T细胞向Treg的分化以及Treg细胞功能的发挥。lncRNA不仅在促进免疫细胞功能方面发挥作用,在控制炎症反应方面也扮演重要的角色。如lncRNA Lethe通过与NF的组分p65(RelA)结合阻止其聚集于靶基因的启动子区,从而影响依赖NF-κB转录的一系列基因的表达,在限制过度炎症反应中发挥重要作用。lincRNA-EPS表达于巨噬细胞及树突状细胞,通过与hnRNPL结合影响染色体的构象和核小体的位置,限制免疫反应相关的因子表达。lncRNA13通过与linc-EPS相似的方式抑制免疫相关基因的表达。lncRNA除了在免疫系统发挥基本的生理功能之外,也参与了免疫相关疾病尤其是自身免疫性疾病的发生发展过程。目前在自身免疫性疾病中研究最多的是表达谱差异表达的研究,如在系统性红斑狼疮、干燥综合征、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎等疾病中均发现了一系列差异表达的lncRNA。关于发病机制的研究,较多的集中于相关性研究,如研究发现lncRNA NEAT1通过MAPK通路促进趋化因子和炎症因子如CXCL-10,IL-6的表达。NEAT1在系统性红斑狼疮中与肾脏受累以及疾病活动度呈正相关,并且和干扰素积分也呈正相关,其在系统性红斑狼疮患者外周血细胞中高表达,推测NEAT1可能通过调控先天免疫应答过程参与SLE的发病。在干燥综合征患者CD4+T细胞中,TMEVPG1表达水平明显升高,且其表达水平与SSA、血沉、IgG呈正相关。在RA中研究发现lncRNA-C5T1可以调控RA易感基因C5的表达,lncRNA-C5T1转录起始于C5的3'非编码区,通过基因敲除技术沉默该lncRNA的表达后,C5的表达水平明显下降。LOC100506036在RA患者T细胞中高表达,沉默该基因后,与RA相关的基因NFAT1(nuclear factor of activated T cells 1)以及SMPD1表达水平下降,推断LOC100506036通过调节SMPD1和NFAT1的基因表达参与RA的炎症反应过程。在RA患者关节滑膜中通过芯片技术分析发现135个lncRNA异常表达,其在62个lncRNA较正常人水平升高,73个表达降低。关于lncRNA在RA患者外周血单个核细胞中的表达情况迄今尚无报道。RA是一种以累及关节为主的代表性慢性炎症性疾病,主要导致进行性关节破坏和血管、骨骼、代谢方面的相关并发症,该病病程迁延,致残率高,常合并全身并发症,严重影响患者的生活质量,给个人、社会造成了很大的社会经济成本。RA发病可以出现在各个年龄段,主要以累及女性为主,在国内发病率为0.3-0.5%。RA的病变主要位于关节腔滑膜组织,典型的病理改变为滑膜翳的形成,在RA受累的关节内可以看到滑膜组织的异常增生、大量炎性细胞的浸润以及骨和软骨组织的破坏。在RA整个病程中免疫紊乱、炎虚反应及滑膜组织增生这三种病理过程相互作用,相互影响,形成了一个错综复杂的网络,致使研究者对RA的发病机制没有明确的定论。随着基础研究对细胞因子认识的逐渐深入,在20世纪80年代,有学者提出RA是由T细胞介导的慢性自身免疫性疾病,并在此基础上开展了许多针对T细胞如(CTLA4)及细胞因子(如IL-6R/TNF/IL-17/IL-1等)的靶向治疗,取得了很好的疗效,稳固了该理论在RA发病中的地位。目前普遍认为机体免疫耐受的缺失,自身免疫调控的失衡,导致RA患者自身免疫系统紊乱,最终引起关节部位一系列炎症反应的发生和持续。其中遗传和环境因素在上述过程中发挥重要作用。基于上述研究背景,本研究将运用基因芯片技术,筛选在RA患者外周血单个核细胞(PBMC)中的差异表达的lncRNA和mRNA;利用生物信息学手段,对差异表达的基因进行GO和KEGG通路的分析,以发现差异表达的基因可能参与的生物学通路。结合已发现的RA的易感基因位点及差异变化的lcnRNA的相关信息等对差异表达的lncRNA进行定量验证及相关性分析,进一步挖掘RA相关的异常表达的lncRNA,探索其在RA发病中的作用,以期通过相关性研究发现临床诊疗中潜在的生物学标志物,实现从实验室成果到临床应用的转化。第一部分lncRNA在RA患者外周血单个核细胞中的差异表达及功能分析目的:应用基因芯片技术筛选RA患者外周血单个核细胞中差异表达的lncRNA和mRNA;通过生物信息学技术分析采用GO和KEGG通路分析差异表达基因参与的生物学通路,探索差异表达的lncRNA和mRNA在RA发病机制中的可能作用。方法:选取2016年6月-12月聊城市人民医院风湿免疫科就诊的27名女性RA患者及健康查体中心年龄匹配的女性健康志愿者,随机分成3组,每组的样本均采用密度梯度离心法分选出外周血单个核细胞,用Trizol溶解后等量混匀应用Arraystar人类lncRNA芯片V4.0进行基因芯片定量。通过GeneSpingGX v12.1软件包对数据进行标准化和分析,差异变化的标准为RA组比正常组表达变化2倍以上,且P0.05。对表达差异变化的lncRNA和mRNA采用散点图、火山图和聚类分析的方法进行聚类分析,以建立差异表达的lncRNA和mRNA的表达谱。对差异表达的lncRNA和mRNA在染色体中的分布情况以及在差异变化的不同倍数值的分布情况进行统计分析,在不同的层面进一步了解差异表达的lncRNA和mRNA的生物信息。利用生物信息技术对差异表达差异显著的mRNA进行GO(gene ontology)和KEGG Pathway(kyoto encyclopedia of Genes and Genomes)分析,以发现差异表达的基因可能参与的生物学通路。结果:通过基因芯片技术分析发现,在芯片总共检测的40173个lncRNAs和20730个mRNAs中,共有2099个lncRNAs和2307个mRNAs在RA患者中差异表达,其中683个lncRNA表达水平升高,1416个lncRNA表达水平降低,331个mRNA表达升高,1976个mRNA表达降低。差异表达的lncRNA和mRNA中,表达下调的比例分别占67.46%和77.85%。对差异表达的lncRNA和mRNA在染色体中的分布进行分析发现,两者在染色体中的分布趋势基本一致,其中在2号染色体异常表达的数目最多,均大于200个,在22号染色体异常表达的数目最少。根据倍数变化值进行分析发现,差异倍数在2-3倍之间的lncRNA和mRNA所占比例均达50%以上,大于10倍的仅占1%。通过GO和KEGG通路分析显示差异表达的mRNA参与了与RA相关的多种生物学过程,如MHC分子及受体,急性时相反应蛋白,细胞粘附分子以及泛素化修饰所介导的蛋白分解等。结论:通过基因芯片分析发现了 RA患者外周血单个核细胞中差异表达的mRNA和lncRNA的表达谱,其中差异表达的基因中均以下调为主,提示基因的表达缺陷或者转录后的RNA降解可能参与了 RA的发病过程。生物信息学分析提示差异表达的lncRNA和mRNA可能参与了 RA发病的多种信号通路。第二部分差异表达的lncRNA在RA中的定量验证及相关性检测目的:应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)的方法验证基因芯片筛选出的差异表达并具有一定研究价值的lncRNA;对统计学差异显著的lncRNA与RA病情相关的临床指标IL-6、TNF-α、疾病活动指标简化疾病活动指数(SDAI)进行相关性检测,以发现可用于RA临床诊断或疾病评估的生物标记物。方法:收集2016年6-12月聊城市人民医院风湿科就诊的36名RA患者及同期年龄及性别均匹配的健康查体中心的24名健康对照者作为验证人群,根据lncRNA的倍数变化值,lncRNA的长度,lncRNA在数据库中是否有确定的序列以及与RA的易感基因的相关性等原则,选取了 6个差异表达的lncRNA(ENST00000456270,NR_002838,NR_026812,uc001zwf.1,ENST00000566394和ENST00000412896)在上述验证人群中应用实时荧光定量PCR的方法进行定量,通过统计学软件GraphPad Prism5采用非参数Mann-Whitney检验进行统计学分析;对表达差异具有统计学意义的lncRNA与RA患者相关临床资料中疾病活动相关的指标血清中IL-6和TNF-α的水平以及SDAI进行Spearman相关性分析。结果:RT-PCR结果显示RA患者中ENST00000456270和NR_002838表达水平较正常对照组升高,差异具有统计学意义(P0.01);NR_026812、uc001zwf.1 和 ENST00000566394 表达水平降低,其中 NR_026812 和uc001zwf.1差异具有统计学意义(P0.01)。ENST00000412896因在RA组和正常对照组均表达量太低未能进行比较分析。Spearman相关性分析显示在RA患者中 ENST00000456270 的水平和临床指标 SDAI(r=0.8347,P0.0001),IL-6(r=0.5653,P=0.0003)及 TNF-α(r=0.4332,P=0.0083)呈显著性正相关,具有统计学意义,NR_002838与SDAI呈显著性正相关(r=0.5191,p=0.0020),而与 IL-6 以及 TNF-α 不具有相关性,NR_026812 和 uc001zwf.1与IL-6,TNF-α和SDAI均不具有相关性。结论:实时荧光定量结果与基因芯片结果基本一致,证实了基因芯片在筛选差异表达基因的可靠性。ENST00000456270可以作为RA疾病活动度评估的一个潜在生物标记物。

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