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鲍内脏抗氧化肽分离纯化和构效关系研究

【摘要】:近几年我国鲍养殖产量不断扩大,然而鲍脏器常被当作鲍加工废弃物没有得到有效利用。已有研究表明,鲍内脏也具有很高的营养价值与利用前景。本课题以福建省南日岛皱纹盘鲍内脏为原料,利用蛋白酶酶解鲍内脏制备抗氧化肽,通过分离纯化、结构鉴定,结合化学合成对抗氧化肽活性进行评价,探讨其构效关系,为开发高活性抗氧化肽提供参考。论文主要研究结果如下:以水解度为评价指标,通过响应面实验,对胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解鲍内脏酶解条件进行优化,得到胰蛋白酶最优酶解条件为料液比1:20 g/mL、加酶量2500 U/g、酶解温度45℃、pH 8.0;碱性蛋白酶最优酶解条件为料液比1:30 g/m L、加酶量3000 U/g、酶解温度55℃、pH 9.5;中性蛋白酶最优酶解条件为料液比1:30 g/m L、加酶量3000 U/g、酶解温度55℃、pH 7.5;木瓜蛋白酶最优酶解条件为料液比1:30 g/m L、加酶量3000 U/g、酶解温度60℃、pH 6.5;在以上条件下,各酶水解鲍内脏3 h原料水解度分别为15.98±0.21、25.14±0.42、18.67±0.32和18.21±0.71%,酶解产物分子量主要分布在5000到400 Da区间,并具有较好的DPPH·清除活性,四种酶解产物DPPH·清除率分别为38.58±0.56,29.65±1.21,28.39±1.88和44.81±1.78%。利用Sephadex G-15凝胶色谱和HW-40f中压制备柱对胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶四种酶的酶解产物进行分离纯化,各得到大分子量肽组分A、中等分子量肽组分D和小分子量肽组分E(分别为AVH-TE,AVH-AE,AVH-NE和AVH-PE),经过体外抗氧化活性测定,四种酶的小分子量肽组分E抗氧化能力均显著高于肽组分A和肽组分D,AVH-TE,AVH-AE,AVH-NE和AVH-PE清除DPPH·自由基IC_(50)分别为0.832、1.935、1.793和1.138 mg/m L,还原力EC_(A700nm=0.5)分别为2.176,3.464,2.107和1.987 mg/m L,亚油酸抑制率分别为90.4±4.88,89.8±1.20,90.2±6.77和89.9±1.4%。采用RP-HPLC分离小分子组分共得到8个主要组分,经ESI-LCMS结构鉴定得到16条目标肽段:METY,YHGF,QCVR,QSCARF,AAPAVSGR,NRFGVSR,PVPPYKA,AAQYSRN,VHAEPTK,GCYVPKC,NSHVVR,AANNSTR,TIDCDR,CIGYDR,DDITRD,DVAFMR。化学合成以上16条肽,进行体外抗氧化活性评价。结果表明,在清除DPPH·自由基和还原力方面,只有含有Cys的肽段才具有明显活性;在清除ABTS·~+自由基方面,含有Cys和Tyr的肽段才具有明显活性;在抑制亚油酸自动氧化方面,含有Tyr、Cys、His、酸性氨基酸以及碱性氨基酸均表现出一定活性,通过相关性分析表明疏水性氨基酸在抑制亚油酸自氧化中具有很大贡献(相关系数为-0.532)。定量构效关系分析结果表明,Cys残基N端相邻的氨基酸的侧链体积大小、碱性氨基酸对DPPH·自由基清除活性具有较大影响;Tyr在肽链中的位置,Tyr邻位氨基酸种类以及碱性氨基酸对清除ABTS·~+自由基具有较大影响。选取YHGF、GCYVPKC、TIDCDR和CIGYDR合成肽,研究它们对细胞氧化损伤的保护作用。结果表明,四条肽段对细胞无毒副作用,都能不同程度的上调细胞内GSH-Px、CAT、SOD抗氧化酶活性,降低细胞内MDA含量和上清LDH漏出液。其中,含有Tyr的YHGF、GCYVPKC和CIGYDR三条合成肽段对降低细胞内MDA含量和细胞上清LDH漏出液的效果强于只含有Cys的TIDCDR;含有Cys的GCYVPKC、TIDCDR和CIGYDR在对过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px的活力影响中均显著强于不含Cys的YHGF。

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