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sigX和flgM基因在变形假单胞菌感染斜带石斑鱼过程中的功能

【摘要】:变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida),又称杀香鱼假单胞菌,是一种需氧型革兰氏阴性杆菌。该菌能引起大黄鱼(Larimichthys crocea)、斜带石斑鱼(Epihephelus coioides)等经济海水鱼类的“内脏白点病”,导致养殖鱼类在短期内大量死亡,造成严重的经济损失。虽然变形假单胞菌在海水养殖领域造成的危害巨大,但是对其致病机制的研究才刚刚起步。在实验室前期测定的变形假单胞菌体外不同温度及致病过程的转录组数据的基础上,本研究以本实验前期实验分离的高致病性变形假单胞菌NZBD9菌株为研究对象,斜带石斑鱼为宿主,结合RNAi和RNA测序技术研究sigX基因和flgM基因在变形假单胞菌感染斜带石斑鱼过程中的功能。主要内容如下:(1)通过RNAi技术分别构建了5株变形假单胞菌sigX基因和flgM基因的沉默突变株,用qRT-PCR测定基因的表达量,结果显示sigX-shRNA-216菌株和flgM-shRNA-18菌株的沉默效果最好,其沉默效率分别达到99.27%和99.72%。以sigX-shRNA-216菌株和flgM-shRNA-18菌株为变形假单胞菌sigX沉默株和flgM沉默株,用于后续研究。(2)以斜带石斑鱼为动物模型,分别测定sigX基因和flgM基因的沉默对变形假单胞菌毒力的影响。结果显示:较变形假单胞菌野生株感染相比,sigX沉默株和flgM沉默株感染导致的斜带石斑鱼存活率分别上升20%和75%;且脾脏表型变化明显,被sigX沉默株感染的脾脏白点直径变小,数量减少;被flgM沉默株感染的脾脏无明显白点。上述结果表明sigX基因和flgM基因是变形假单胞菌的毒力基因,在变形假单胞菌感染斜带石斑鱼的过程中发挥重要作用。(3)通过各菌株生长曲线测定实验和斜带石斑鱼脾脏,肝脏,头肾,体肾组织和血液对菌株的载量测定实验发现,变形假单胞菌sigX沉默株和flgM沉默株在体外条件下生长速率与野生株无明显差异,在组织中的载量较野生株明显降低。(4)用qRT-PCR测定变形假单胞菌不同菌株感染斜带石斑鱼后1d,2d,3d,4d的脾脏组织中sigX和flgM基因的表达水平,结果显示sigX沉默株中的sigX基因表达水平在各个时间点都极显著低于野生株;flgM沉默株中的flgM基因表达水平在各个时间点也都极显著低于野生株。这些结果表明本文所构建的沉默突变株的沉默效果稳定,在整个感染过程中基因都保持沉默状态。(5)与变形假单胞菌野生株感染的斜带石斑鱼脾脏转录组相比,sigX沉默株的感染引起斜带石斑鱼脾脏转录组丝氨酸型肽链内切酶活性GO功能集和产生IgA的肠免疫网络通路、补体系统和凝血级联反应通路和趋势因子信号通路上调表达。富集到这些通路中的差异表达基因通过数量不等的lncRNA或miRNA联系在一起。(6)与变形假单胞菌野生株感染的斜带石斑鱼脾脏转录组相比,变形假单胞菌flgM沉默株的感染引起斜带石斑鱼脾脏转录组16个免疫相关的通路发生变化。通过WGCNA分析发现,这些免疫通路与细胞群体、信号转导、信号分子和相互作用、血液循环系统、氨基酸代谢和细胞运动性这些功能相互协调。

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