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RK21_RS10315毒力基因在变形假单胞菌感染斜带石斑鱼过程中的功能

【摘要】:变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是一种分布广泛的革兰氏阴性菌,并且具有很强的致病性,能够对养殖产业造成严重的经济损失。然而,关于变形假单胞菌致病机制的研究还处于起步阶段,已经验证的毒力基因也非常之少。本研究以变形假单胞菌为病原,以斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)为宿主,结合RNA干扰和dual RNA-seq技术研究变形假单胞菌的一个转录调节子基因(RK21_RS10315)在病原-宿主互作中的功能。首先通过比较体外培养变形假单胞菌与被感染24h,48h,72h,96h的斜带石斑鱼脾脏中变形假单胞菌转录组数据的差异挑选出在体内显著高表达的RK21_RS10315基因。针对该基因设计了5个RNAi靶点的shRNA序列,用pCM130/tac质粒分别构建稳定沉默突变株。利用实时荧光定量PCR技术检测沉默效率,结果发现针对574靶点shRNA的沉默效果最好,沉默效率达到了96.1%。然后,分别用沉默株和野生株变形假单胞菌感染斜带石斑鱼,发现野生株感染的斜带石斑鱼体表无明显特征,脾脏表面有密集的大小不等的白色结节,而由于目的基因的沉默导致被感染鱼的死亡率下降了90%,而且脾脏器官的白色结节症状也有所减轻,这也证实了RK21_RS10315毒力候选基因的致病性。将分别被变形假单胞菌野生株和RK21_RS10315-RNAi突变株感染48h的斜带石斑鱼脾脏进行dual RNA-seq,通过两组数据的比较来分析RK21_RS10315基因在变形假单胞菌与斜带石斑鱼的病原-宿主互作中的功能。被感染的斜带石斑鱼脾脏中包含有两部分转录组数据,分别是变形假单胞菌的转录组数据和斜带石斑鱼的转录组数据。分析发现斜带石斑鱼的转录组数据中共有差异基因22010个,其中差异上调的有4321个,差异下调的有17689个,变形假单胞菌的转录组数据中共有差异基因65个,其中差异上调的有50个,差异下调的有15个。斜带石斑鱼的转录组数据中的差异基因通过KEGG富集分析,发现了16个免疫显著相关的通路,其中ko04672和ko04670两个富集通路占有一定的比重。ko04672和ko04670两个富集通路中的19个差异基因(euk-DEMs)与变形假单胞菌转录组数据中的19个差异基因(pro-DEMs)做基因共表达网络分析,结果发现它们之间具有不同程度的相关性,还发现来自变形假单胞菌转录组数据中的ipxA,grpE,yhbJ,truD和suhB这些差异基因在共表达网络中占有重要位置。它们的表达很可能与变形假单胞菌中的RK21_RS10315基因的沉默相关。RK21_RS10315基因影响着变形假单胞菌的致病性,dual RNA-seq同时检测分别被变形假单胞菌野生株和RK21_RS10315-RNAi突变株感染48h的斜带石斑鱼脾脏,转录组数据做进一步的生物信息学分析发现病原宿主差异基因之间的相关性,基因沉默后的病原-宿主互作证实了与变形假单胞菌中的RK21_RS10315基因密切相关。

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